Укоренение in vitro и адаптация к нестерильным условиям российских сортов брусники обыкновенной

Б русника обыкновенная ( Vaccinium vitis-idaea L.) – один из наиболее востребованных на российском рынке лесных ягодных видов, хозяйственно ценных в пищевом и лекарственном отношении [1, 2]. Ввиду интенсивного сокращения естественных запасов ягодников и неустойчивой урожайности создание плантаций лесных ягодных растений, в частности на выработанных торфяных месторождениях, в настоящее время имеет большое народнохозяйственное и природоохранное значение и является одним из наиболее актуальных направлений исследований в лесном и сельском хозяйстве [3, 4]. Эффективность биологической рекультивации выработанных торфяных месторождений подтверждена опытом [5, 6].

Для успешного экономически эффективного выращивания ягодных растений в промышленных масштабах одним из основных условий является использование сортового посадочного материала, однако имеющиеся сорта брусники обыкновенной зарубежной (европейской) селекции предназначены для достаточно мягких климатических условий и по ряду важнейших признаков (зимостойкость, срок созревания ягод и др.) не подходят для выращивания во многих регионах России [7–9]. На Костромской (ныне – Центрально-европейской) лесной опытной станции ВНИИЛМ в результате многолетних селекционных работ в 1990-х гг. были выведены первые российские сорта брусники обыкновенной (Костромская розовая, Костромичка, Рубин), перспективные для выращивания на плантациях в природно-климатических условиях Нечерноземной зоны европейской части России [10].

При плантационном выращивании лесных ягодных растений целесообразно использовать метод клонального микроразмножения, позволяющий в короткие сроки получить большое количество оздоровленного высококачественного посадочного материала вне зависимости от сезонности [11, 12]. В результате исследований по микроклонированию брусники обыкновенной установлено, что способность данного вида к регенерации in vitro в большой степени зависит от генотипа [13–15], при этом до настоящего времени проведено очень мало исследований по микроклонированию и адаптации ex vitro сортов и гибридов отечественной селекции [16, 17].

Укоренение микропобегов – наиболее сложный этап клонального микроразмножения, от которого зависит эффективность предлагаемой технологии. Основным регуляторным фактором корнеобразования является присутствие в составе питательной среды ауксинов, при этом выбор гормона и его концентрация зависят от видовых и сортовых особенностей исследуемых растений [11, 18]. Адаптация растений-регенерантов к нестерильным почвенным условиям – самый ответственный этап, который завершает процесс клонального микроразмножения. Ключевым моментом на этапе адаптации является обеспечение оптимальных условий для роста и развития растений путем регулирования химических и физических факторов, что достигается правильным выбором состава субстрата, типов и концентраций росторегулирующих веществ и т.д. [19, 20]. Одним из наиболее эффективных способов адаптации может стать гидропонный метод, особенность которого заключается в выращивании растений без почвы с применением искусственных субстратов различного происхождения. К основным преимуществам этого метода по сравнению с традиционными относятся: возможность управления ростом и развитием растений на протяжении всего вегетационного периода, тщательный контроль качества готовой продукции, возможность применения готовых долговечных гидропонных систем, комплексных минеральных удобрений и многоспектральных источников искусственного освещения с учетом биологических особенностей культуры [21–25].

Цель исследований – изучить особенности клонального микроразмножения российских сортов брусники обыкновенной на этапе укоренения микропобегов, а также при адаптации растений-регенерантов к нестерильным условиям.

Объекты и методы исследований

Исследования по клональному микроразмножению растений и адаптации их к нестерильным условиям проводили в лабораториях биотехнологии на базе Центрально-европейской лесной опытной станции ВНИИЛМ и Сургутского государственного университета в 2021–2023 гг. по общепринятым методикам [20, 26]. В качестве исследуемых объектов использовали растения брусники обыкновенной (Vaccinium vitis-idaea L.) сортов Костромская розовая и Костромичка.

На этапе введения в культуру in vitro экспланты растений стерилизовали в растворах нитрата серебра (0,2 %) и препарата Лизоформин 3 000 (5 %) в течение 10 мин. На этапе пролиферации использовали питательную среду Андерсона [27]. В качестве регулятора роста цитокининовой группы применяли 2-изопентиладенин (2-iP) в концентрациях 1,0–2,0 мг/л. На этапе укоренения in vitro микрочеренки брусники пересаживали на питательную среду Андерсона с добавлением ауксинов – индолилмасляной (ИМК) и индолилуксусной (ИУК) кислоты в концентрациях 1,0 и 2,0 мг/л. Культивирование проводили в течение 30–50 сут в условиях световой комнаты при освещении 2 500–3 000 лк, 16-часовом фотопериоде, температуре воздуха +25 °C, относительной влажности воздуха 80 %. Учитывали количество, среднюю и суммарную длину корней в расчете на одно растение-регенерант. Повторность опыта – 10-кратная, по 30 растений в каждой. Применяли двухфакторный дисперсионный анализ, где: фактор A – тип ауксина, фактор B – его концентрация. Оценку достоверности проводили при помощи наименьшей существенной разности для 5 %-го уровня значимости (НСР₀₅).

Полученные в условиях in vitro растения с хорошо развитой корневой системой адаптировали к нестерильным условиям ex vitro со второй декады марта по третью декаду мая. Растения доставали пинцетом из пробирки и для предотвращения развития патогенной микрофлоры промывали корни в 1 %-м растворе перманганата калия (KMnO4). После чего укорененные растения пересаживали в кассеты с объемом ячеек 81,7 и 100 см3 с различными по составу субстратами и поливали водой. Затем растения опрыскивали водой из пульверизатора и надевали колпачки. Предварительно субстраты проливали 5 %-м раствором KMnO4 и оставляли на 14 сут в темном месте. В качестве субстрата для адаптации использовали торф верхового типа (pHKCl – 2,8–3,5), а также торф в смеси с песком (в соотношении 1:1), вермикулитом (1:4) и перлитом (1:4). Адаптацию растений осуществляли при освещении 8 000 лк, температуре +25 °C и влажности 80–90 %. Ежедневно в течение 7 сут растения опрыскивали, после чего выполнили первую подкормку составом питательной среды Woody Plant Medium (WPM) с уменьшенной в 5 раз концентрацией минеральных солей. Через 10 сут провели первую ревизию растений. Дальнейшее их выращивание проходило по принятой агротехнике [20, 28]. Приживаемость растений определяли по отношению количества выживших к количеству высаженных, учитывали количество побегов и образовавшихся листьев. Повторность опыта 3-кратная.

Помимо этого, осуществляли адаптацию растений-регенерантов с применением гидропонного метода в режиме периодического подтопления в гидропонной установке вертикального типа. Она представляет собой стеллаж высотой 198 см, шириной 132 см, с двумя поддонами размером 130x50 см, крышками с отверстиями для горшочков диаметром 6 см, баком для питательного раствора объемом 100 л, насоса, питающих и возвратных шлангов для транспортировки питательного раствора, которые соединяют бак с поддоном. Преимущество системы подтопления состоит в обеспечении хорошей оксигенации корней, при этом подъем воды вытесняет отработанный воздух из корневой зоны, а понижение воды обеспечивает поступление свежего воздуха [21, 22]. Укоренившиеся в условиях in vitro растения вынимали из пробирки, промывали от агара в дистиллированной воде и растворе KMnO4. Затем растения помещали в горшочки диаметром 6 см, заполненные на 1/3 стерильным керамзитом с размером фракций 0,5–1,0 см, и ставили в лотки с прозрачными крышками для поддержания высокой влажности воздуха. Сверху горшочки накрывали колпаком для создания высокой влажности и помещали на стеллаж с освещением белыми светодиодными лампами (световой поток – 8 000 Лм, цветовая температура – 4 000 K, РРF – 165 мкмоль/м2/с), расположенными над растениями на высоте 50 см. На протяжении всего вегетационного периода растения выращивали при 16-часовом световом режиме. Подачу питательного раствора осуществляли в течение 15 мин 6 раз в 1 сут. В качестве удобрений использовали полностью растворимое комплексное удобрение с микроэлементами Yara Ferticare Hydro (NPK 6:14:30) и кальциевую селитру Ca(NO3)2. В течение 10 сут концентрацию

Рис. 1. Корнеобразование in vitro брусники обыкновенной сортов Костромская розовая (1) и Костромичка (2) на питательной среде Андерсона с добавлением ауксинов: а – ИМК; б – ИУК солей увеличивали до 1,3 мСм/см, а после 20 сут культивации – до 1,8 мСм/см. Уровень кислотности (рН) – 5,8–6,0. Замену питательного раствора осуществляли каждые 12 сут. Систематически через 10, 20, 30 и 40 сут после пересадки проводили учет приживаемости (соотношение числа выживших экземпляров и числа высаженных, %) и морфометрических показателей роста растений (число и длина побегов, число листьев, число и длина корней). Повторность опыта 3-кратная, по 100 растений в каждой.

Статистическую обработку экспериментальных данных проводили с использованием программного обеспечения Microsoft Office Excel 2016, StatSoft STATISTICA 10.0.1011 и AGROS v.2.11.

Результаты и обсуждение

На этапе укоренения микропобегов ауксины ИМК и ИУК в разных концентрациях оказывали различное влияние на корнеобразование брусники обыкновенной в культуре in vitro (рис. 1).

Наибольшее количество корней брусники обыкновенной in vitro на питательной среде Андерсона отмечалось в вариантах с ИУК в концентрации 2,0 мг/л и составило у исследуемых сортов в среднем 4,3–4,4 шт.

При использовании ИМК и ИУК в концентрации 1,0 мг/л значения данного показателя были в 1,9–2,3 раза ниже, чем при концентрации 2,0 мг/л. Статистически значимых различий по количеству корней в зависимости от сорта не выявлено (табл. 1).

Средняя длина корней брусники обыкновенной in vitro имела наибольшие значения при использовании ауксинов ИМК и ИУК в концентрации 1,0 мг/л – в среднем 4,1–4,5 см, что в 1,9–2,3 раза превышало значения при концентрации 2,0 мг/л (табл. 2). Статистически значимых различий показателя в зависимости от сорта не выявлено.

Суммарная длина корней брусники обыкновенной in vitro у сорта Костромичка была максимальной (в среднем 11,9 см) в варианте

Таблица 1. Количество корней брусники обыкновенной in vitro на питательной среде Андерсона в зависимости от концентрации ауксинов, шт.

Сорт	Ауксин		Концентрация ауксина, мг/л		Среднее
			1,0	2,0
Костромская розовая	ИМК		1,9	4,2	3,0
	ИУК		2,0	4,4	3,2
Среднее			1,9	4,3	-
НСР05 фактор А = 0,98, фактор В		=1,10, общ. =	1,65
Костромичка	ИМК		2,1	3,9	3,0
	ИУК		2,4	4,3	3,3
Среднее			2,2	4,1	-
НСР05 фактор А = 1,10, фактор В		= 1,31, общ.	1,49

Таблица 2. Средняя длина корней брусники обыкновенной in vitro на питательной среде Андерсона в зависимости от концентрации ауксинов, см

Сорт Ауксин Концентрация ауксина, мг/л Среднее 1,0 2,0 Костромская розовая ИМК 3,2 2,3 2,7 ИУК 5,8 2,7 4,2 Среднее 4,5 2,5 - НСР05 фактор А = 0,64, фактор В = 0,78, общ. = 0,93 Костромичка ИМК 3,0 1,8 2,4 ИУК 5,2 1,5 3,3 Среднее 4,1 1,6 - НСР05 фактор А = 0,72, фактор В = 0,96, общ. = 1,10 с ауксином ИУК в концентрации 1,0 мг/л – в 1,9 раза выше, чем при концентрации 2,0 мг/л.

Для сорта Костромская розовая статистически значимых различий показателя в зависимости от концентрации ИУК и ИМК не отмечено. При использовании ауксина ИУК средние значения суммарной длины корней брусники сорта Костромская розовая были в среднем в 1,9 раза выше, чем в вариантах с добавлением ИМК (табл. 3).

После пересадки укорененных растений брусники обыкновенной исследуемых сортов российской селекции в емкости с торфяными субстратами установлено, что лучшим периодом адаптации к нестерильным условиям ex vitro является май. В среднем за май наиболее высокая приживаемость (92–94 %) наблюдалась на субстрате из верхового торфа, тогда как при использовании смесей торфа с вермикулитом (1:4) и с перлитом (1:4) она незначительно (в 1,1–1,2 раза) ниже. Это позволяет рекомендовать данные субстраты для адаптации брусники исследуемых сортов к нестерильным условиям ex vitro. При адаптации растений на смеси торфа с песком приживаемость не превышала 70 % (табл. 4).

По числу побегов (в среднем 4,2–5,3 шт.) в мае адаптируемые растения-регенеранты брусники исследуемых сортов не имели статистически значимых различий в зависимости от состава субстрата, однако сорт Костромичка несколько превосходил по данному показателю сорт Костромская розовая. Наибольшее число листьев

Таблица 3. Суммарная длина корней брусники обыкновенной in vitro на питательной среде Андерсона в зависимости от концентрации ауксинов, см

Сорт	Ауксин	Концентрация ауксина, мг/л		Среднее
		1,0	2,0
Костромская розовая	ИМК	6,1	6,3	6,2
	ИУК	11,6	12,5	12,0
Среднее		8,8	9,4	-
НСР05 фактор А = 0,79, фактор В = 0,84, общ. = 1,10
Костромичка	ИМК	9,6	7,0	8,3
	ИУК	11,9	6,4	9,1
Среднее		10,7	6,7	-
НСР05 фактор А = 0,87, фактор В = 0,96, общ. = 1,19

Таблица 4. Приживаемость и средние биометрические показатели адаптируемых растений брусники обыкновенной на субстратах с содержанием торфа

Субстрат	Период адаптации	Приживаемость, %	Число побегов, шт.	Число листьев, шт.
Костромская розовая
Торф верховой	Март	64	2,9±0,18	22,1±0,44
	Апрель	80	4,3±0,11	39,3±0,73
	Май	92	4,8±0,17	42,1±0,84
Торф + песок (1:1)	Март	48	2,3±0,11	18,2±0,33
	Апрель	59	1,9±0,16	18,2±0,27
	Май	68	2,3±0,10	20,3±0,36
Торф + вермикулит (1:4)	Март	61	3,0±0,19	24,6±0,42
	Апрель	74	3,9±0,26	29,3±0,38
	Май	82	4,3±0,23	43,2±0,92
Торф + перлит (1:4)	Март	55	3,8±0,30	30,2±0,70
	Апрель	67	3,5±0,27	33,9±0,29
	Май	79	4,2±0,27	42,3±0,86
Костромичка
Торф верховой	Март	60	3,2±0,23	22,4±0,47
	Апрель	82	3,9±0,17	27,2±0,84
	Май	94	4,3±0,21	36,9±0,68
Торф + песок (1:1)	Март	40	3,0±0,19	19,6±0,39
	Апрель	62	4,2±0,12	33,9±0,79
	Май	60	5,3±0,64	44,3±0,90
Торф + вермикулит (1:4)	Март	64	3,9±0,74	39,3±0,85
	Апрель	80	4,6±0,80	36,8±0,75
	Май	86	5,2±0,73	48,9±0,99
Торф + перлит (1:4)	Март	52	3,2±0,40	27,9±0,73
	Апрель	72	4,5±0,36	42,3±0,69
	Май	76	5,1±0,84	47,3±0,81

(в среднем 36,9–48,9 шт.) в мае наблюдалось у растений брусники обоих сортов, адаптируемых на верховом торфе, смеси торфа с вермикулитом (1:4) и с перлитом (1:4), а также у сорта Костромичка на смеси торфа с песком (1:1), в то время как этот показатель у сорта Костромская розовая на том же субстрате оказался в 2,2 раза ниже (рис. 2).

Анализ данных, полученных при выращивании растений-регенерантов на гидропонной установке, показал, что исследуемые сорта брусники обыкновенной обладают высокой адаптационной способностью (пластичностью). В гидропонной системе периодического подтопления приживаемость растений-регенерантов на 40-е сут после пересадки составляла 90–94 %. Наиболее отзывчивым к условиям выращивания (температура, влажность, питательный раствор, освещение) оказался сорт Костромичка, у которого приживаемость растений составила 94 % (табл. 5).

У регенерантов брусники обыкновенной независимо от сортовой принадлежности за весь период адаптации на гидропонной установке наблюдался интенсивный верхушечный рост, активное развитие ассимиляционного аппарата и корневой системы. В конце периода адаптации (на 40-е сут) различия по показателям роста между сортами были статистически незначимы, за исключением длины корней, которая у сорта Костромичка была в 1,4 раза больше, чем у сорта Костромская розовая (табл. 6).

Биометрические характеристики адаптируемых растений-регенерантов брусники обыкновенной свидетельствуют об эффективности используемых приемов адаптации, способствующих формированию побегов с хорошо развитым

А                   Б                   В

Рис. 2. Адаптируемые растения брусники обыкновенной сорта Костромская розовая ex vitro на субстратах: а – торф + песок (1:1); б – торф + перлит (1:4); в – торф + вермикулит (1:4)

листовым аппаратом и корневой системой, что обеспечивает интенсивное развитие саженцев при высадке в открытый грунт.

Выводы

Таким образом, по результатам проведенных исследований можно сделать следующие выводы:

• 1.    При клональном микроразмножении брусники обыкновенной сортов российской селекции на этапе «укоренение микропобегов» максимальное количество корней in vitro зафиксировано при добавлении в питательную среду Андерсона ауксина ИУК в концентрации 2,0 мг/л, а наибольшая суммарная длина корней у сорта Костромичка – при использовании ИУК в концентрации 1,0 мг/л, у сорта Костромская розовая – при концентрации 2,0 мг/л.

• 2.    Адаптацию растений-регенерантов брусники обыкновенной российских сортов Костромичка и Костромская розовая к нестерильным условиям следует проводить в течение мая, при этом лучшими субстратами являются верховой торф и смеси торфа с вермикулитом (1:4) и перлитом (1:4).

• 3.    Биометрическиепоказателиадаптируемых к нестерильным условиям растений-регенерантов

• 4.    Использование клонального микроразмножения и гидропоники перспективно для получения высококачественного сортового посадочного материала брусники обыкновенной с целью дальнейшего выращивания на ягодных плантациях.

Таблица 5. Приживаемость адаптируемых растений-регенерантов брусники обыкновенной российских сортов на гидропонной установке, %

Сорт	Период адаптации, сут
	10-е	20-е	30-е	40-е
Костромская розовая	52	70	82	90
Костромичка	58	62	80	94

Таблица 6. Средние биометрические показатели адаптируемых растений-регенерантов брусники обыкновенной российских сортов на гидропонной установке

Сорт	Период адаптации, сут	Длина побегов, см	Число побегов, шт.	Число листьев, шт.	Число корней, шт.	Длина корней, см
Костромская розовая	10-е	4,8±0,19	2,3±0,26	6,3±0,87	1,8±0,13	2,3±0,18
	20-е	5,2±0,16	3,3±0,15	12,9±0,93	3,6±0,59	4,3±0,46
	30-е	7,4±0,23	4,9±0,29	17,8±0,87	5,7±0,68	8,9±0,82
	40-е	12,3±0,37	5,2±0,38	30,2±1,02	8,3±0,97	10,3±0,90
Костромичка	10-е	3,9±0,21	1,9±0,19	5,9±0,74	2,0±0,24	1,9±0,13
	20-е	5,5±0,24	3,8±0,27	11,3±0,91	4,2±0,62	3,8±0,28
	30-е	8,2±0,42	7,8±0,42	19,6±0,80	7,9±0,80	10,1±0,85
	40-е	13,8±0,52	6,0±0,61	29,6±1,12	9,3±0,98	14,2±0,79

брусники обыкновенной российских сортов с применением гидропонного метода имели наибольшие значения на 40-е сут после пересадки.