Ультраструктурные и иммуногистохимические исследования реактивных и адаптивных преобразований большого сальника при опухолевом поражении яичников

Шевлюк Н.Н., Ганцев Ш.Х., Халикова Л.В., Халиков А.А., Шарафутдинова Л.А., Ишмуратова К.Р. Ультраструктурные и иммуногистохимические исследования реактивных и адаптивных преобразований большого сальника при опухолевом поражении яичников// Морфологические ведомости.- 2020.- Том 28.- № 4.- С. 46-54. (4):540

Shevlyuk NN, Gantsev ShKh, Khalikova LV, Khalikov AA, Sharafutdinova LA, Ishmuratova KR. Ultrastructural and immunohistochemical studies of reactive and adaptive transformations of the greater omentum in ovarian cancer. Morfologicheskie Vedomosti – Morphological Newsletter. 2020;28(4):46-54. (4):540

Введение . Большой сальник является одним из органов, в котором выявляются метастазы опухолей женской репродуктивной системы [1-7]. К настоящему времени опубликовано большое количество работ, касающихся различных фундаментальных и клинических аспектов злокачественных новообразований органов женской репродуктивной системы [1, 3, 6-12], выявлены основные механизмы опухолевой трансформации клеточных элементов яичника и их метастазирования в структуры большого сальника [3, 12-13], показаны пути метастазирования опухолей яичника в большой сальник [3, 12], выявлены основные закономерности и установлены иммуногистохимические маркеры ангиогенеза при метастазировании опухолей [14], установлен ряд иммуногистохимических маркеров клеточной адгезии, экспрессирующихся в опухолевых клетках при их метастазировании в большой сальник. Имеются работы, касающиеся вопросов иммунной защитной функции большого сальника [15-19]. В них показано, что лимфоидная ткань органа локализуется преимущественно в области так называемых «млечных пятен» [15-19]. Однако многие стороны реактивных и адаптивных морфофункциональных перестроек большого сальника при опухолевом процессе в яичниках, вопросы роли и значимости структур большого сальника в процессах развития опухолей яичников по-прежнему остаются недостаточно изученными и нуждаются в уточнении и дополнении [3, 7, 12]. К числу недостаточно исследованных вопросов относятся также вопросы адаптивных и репаративных возможностей незатронутых метастазами участков сальника [7].

Цель исследования : установление морфологических, включая ультраструктурные, и иммуногистохимических изменений большого сальника у женщин с опухолевым поражением яичников.

Материалы и методы исследования . Объектом исследования служили большие сальники 48 женщин, у которых была диагностирована низкодифференцированная серозно-папиллярная аденокарцинома высокой степени злокачественности II и III стадий. 20 пациенток имели опухоль яичников без метастазов в большом сальнике (II стадия). У 28 пациенток было выявлено метастатическое поражение большого сальника (III стадия). Возраст пациенток составлял от 50 до 65 лет. Для сравнения исследовали сальники 16 пациенток, которым была проведена экстирпация сальника во время операций по удалению доброкачественных опухолей яичника. Материал для морфологических исследований (биоптаты большого сальника) получали в Республиканском клиническом онкологическом диспансере, в отделении танатологии Бюро судебно-медицинской экспертизы Минздрава Республики Башкортостан, в центральном патологоанатомическом отделении Городской клинической больницы № 13 (Уфа, Россия). Исследовали поверхностные и внутренние участки большого сальника, при этом у пациенток с метастазами опухоли в большом сальнике исследовали участки, содержащие опухолевые узлы, около-опухолевые участки и участки, расположенные далеко от метастазов. Для светооптических исследований материал фиксировали в 12% нейтральном растворе формалина, обезвоживали в спиртах возрастающей крепости и заливали в парафин. Гистологические срезы толщиной 5–7 микрон окрашивали обзорными гистологическими (гематоксилином Майера и эозином) и иммуногистохимическими методами. Для электронно-микроскопического исследования использовали сканирующий растровый

Морфологические ведомости – Morphological Newsletter: 2020 Том (Volume) 28 Выпуск (Issue) 4 электронный микроскоп Tescan Vega-3SBH (Чехия) с вольфрамовым термокатодом. При подготовке к ультраструктурным исследованиям большого сальника производили деэпителизацию брюшины. Сушка поверхности образцов осуществлялась с помощью установки «FinecoatIonsputter JFC 1100» (JEOL, Япония). На этой же установке проводилось катодное напыление на исследуемую поверхность тонкого слоя золота.

В препаратах, окрашенных с помощью иммуногистохимических методов, выявляли экспрессию белков ki67, Р53, CD34, CD44, CD7, CD4, CD8, D2-40. Иммуногистохимическое окрашивание проводили в соответствии со стандартными протоколами с применением следующих моноклональных антител: моноклональные мышиные антитела к ki67 anti-ki67 («DiagnosticBioSystems», США, клон MMIsameasMB67), в разведении 1:600; моноклональные мышиные антитела к человеческому протеину Р53, клон DO-7, («DiagnosticBioSystems», США) в разведении 1:100; моноклональные мышиные антитела к человеческим эндотелиальным клеткам CD34, клон QBEND/10 («DiagnosticBioSystems», США), в разведении 1:50; моноклональные мышиные антитела к CD7, клон СВС.37 («DiagnosticBioSystems», США), в разведении 1:10; моноклональные мышиные антитела к трансмембранному гликопротеиду Т-хелперов/индукторов   CD4,   клон   1f6

(«DiagnosticBioSystems», США), в разведении 1:30; моноклональные мышиные антитела к человеческим Т-лимфоцитам CD8, клон 144В («DiagnosticBioSystems», США), в разведении 1:50; моноклональные мышиные антитела к человеческому маркеру эндотелиоцитов D2-40, клон D2-40 (Dako, Дания) в разведении 1:100. При разведении антител использовали разбавитель Antibody Diluent («SPRING Bioscience», США). Использовалась система детекции – Reveal Polyvalent HRP – DAB Detection System («SPRING Bioscience», США). Окраска проводилась ручным и аппаратным способом с использованием гистостейнера Ventanaxt.

На условной единице площади окрашенных гематоксилином Майера и эозином гистологических срезов больших сальников проводили морфометрию структур большого сальника, учитывали количество сосудов микроциркуляторного русла и их размерные характеристики. На срезах, окрашенных иммуногистохимическими методами, проводили подсчет клеток, в которых выявлялась экспрессия соответствующих белков. С помощью критерия Шапиро-Уилка (Shapirо-Wilk’s W-test) проводили анализ соответствия вида распределения количественных признаков закону нормального распределения. Сравнительный анализ групп проводился с помощью непараметрических методов (U-критерий Манна-Уитни). Различия считали статистически значимыми при p<0,05. Для выполнения работы было получено добровольное информированное согласие пациенток на участие в исследовании, а также положительное заключение локального этического комитета Оренбургского государственного медицинского университета (протокол заседания локального этического комитета № 237 от 16 октября 2019 года).

Рис. 1 . Фрагмент большого Рис. 2. Среднее число ki67, P53, CD7- , CD-8, D240, сальника пациентки 54 лет с CD44 иммунопозитивных клеток в большом сальнике метастазами опухоли. Окр.: пациенток с метастазами опухоли и без метастазов гематоксилином Майера и опухоли в большом сальнике.

эозином. Ув.: х400.

При сравнении участков большого сальника, пораженного метастазами и участков, где метастазы отсутствовали, была отмечена выраженная экспрессия маркера лимфатических эндотелиоцитов D2-40 (рис. 2). Это свидетельствует о процессах неолимфогенеза в исследуемых зонах. В эндотелии капилляров большого сальника без метастазов эндотелиальные клетки практически не различаются по форме. В капиллярах и венулах около-опухолевой зоны наблюдаются очаговые повреждения эндотелия, во многих капиллярах и венулах отмечен застой форменных элементов. Отмеченные явления обеспечивают возрастание миграции лейкоцитов из кровеносных сосудов. Вокруг многих сосудов микроциркуляторного русла отмечается очаговая, либо диффузная лейкоцитарная инфильтрация, среди лейкоцитов преобладали лимфоциты.

Анализ результатов иммуногистохимических реакций показал, что как в опухоли, так и вблизи ее выявляется большое количество клеток, экспрессирующих маркеры, свойственные популяциям Т-лимфоцитов - CD7 и CD8 (рис. 3-4). В некоторых препаратах отмечалось наличие выраженного лейкоцитарного вала вокруг метастазов.

Рис. 4. Фрагмент большого сальника пациентки 58 лет с метастазами опухоли в большом сальнике. Иммуногистохимическое выявление экспрессии CD7. Ув.: х400.

Рис. 3. Фрагмент большого сальника пациентки 58 лет с метастазами опухоли в большом сальнике. Иммуногистохимическое выявление экспрессии CD8. Ув.: х400.

Рис. 5. Поверхность деэпителизированного Рис. 6. Увеличенный фрагмент рисунка 5. участка серозной оболочки, не поражен- Масштаб указан на рисунке.

ного метастазами большого сальника пациентки 56 лет в области млечного пятна.

Масштаб указан на рисунке.

Ультрамикрофотографии демонстрируют рыхлое расположение коллагеновых фибрилл и наличие отверстий разного размера в соединительной ткани серозной оболочки.

В ряде работ показано наличие так называемых «стомат» (пор) в поверхностном слое (мезотелии) серозной оболочки сальника, а также серозно-лимфатических насасывающих люков в серозных оболочках, обеспечивающих связь между перитонеальным пространством и лимфатическими капиллярами органов брюшной полости [23].

Рис. 7. Фрагмент деэпителизированной поверхности серозной оболочки большого сальника пациентки 58 лет с метастазами опухоли в большой сальник. Ультрамикрофото демонстрирует перемещение клетки через отверстие в серозной оболочке большого сальника. Масштаб указан на рисунке.

Рис. 8. Фрагмент деэпителизированной поверхности серозной оболочки большого сальника пациентки 56 лет с метастазами опухоли в большом сальнике. Ультрамикрофото демонстрирует плотное расположение пучков коллагеновых волокон в соединительной ткани серозной оболочки. Масштаб указан на рисунке.

Рис. 9. Фрагмент большого сальника пациентки 58 лет с метастазами опухоли в большом сальнике. Иммуногистохимическое выявление экспрессии белка ki67. Увеличение: х400.

Рис. 10. Фрагмент большого сальника пациентки 58 лет с метастазами опухоли в большом сальнике. Иммуногистохимическое выявление экспрессии белка Р53. Увеличение: х400.

Проведенный ультраструктурный анализ показал, что основу плотной соединительной ткани серозной оболочки большого сальника в области «млечного пятна» составляют коллагеновые фибриллы. Пучки коллагеновых фибрилл существенно различаются по толщине и ориентированы в различных направлениях. При этом плотность распределения пучков вариабельна в разных участках сальника. В серозной оболочке имеются участки, в которых соединительнотканная основа истончена, в этих участках наблюдаются отверстия, которые способствуют обмену жидкости между сальником и перитонеальным пространством. Наибольшее число таких отверстий выявляется в области так называемых «млечных пятен» сальника, которые ассоциируются с лимфоидной тканью. Из литературы известно, что величина отверстий в листках брюшины существенно различается, а также, что наибольшие по размеру отверстия содержатся в серозной оболочке, покрывающей диафрагму [12, 23]. Согласно нашим данным, в серозной оболочке большого сальника размеры этих отверстий варьируют в пределах от 2,5 мкм до 25 мкм. Более рыхлое расположение коллагеновых фибрилл и наличие отверстий разного размера в соединительной ткани серозной оболочки определялось в сальнике, не пораженном метастазами, тогда как в сальнике с метастазами расположение коллагеновых волокон было более плотным (рис. 5-8). Поскольку эти отверстия представляют собой промежутки между пучками коллагеновых волокон, очевидно, что они являются непостоянными образованиями и могут формироваться в любых участках серозной оболочки. Различия в диаметре этих отверстий, по-видимому, обусловлены объемом и скоростью транспорта жидкости и клеток через них, то есть со степенью их функциональной активности. Различный диаметр отверстий, также, вероятно, является отражением разных по времени стадий формирования и закрытия этих структур. Нами не было выявлено закономерностей в распределении этих отверстий между участками сальника без метастазов и около-опухолевыми участками. Анализ электронограмм показал, что эти отверстия позволяют перемещаться из сальника в перитонеальное пространство и обратно не только жидкости, но также и различным клеткам как иммуноцитам, так и опухолевым клеткам. Рисунок 4 демонстрирует проходящую через отверстие в серозной оболочке клетку. Расположение фибриллярных структур в непораженных метастазами участках сальника было более рыхлым по сравнению с участками с метастазами и около-опухолевыми участками (рис. 5– 8). В связи с этим, формирование отверстий между коллагеновыми пучками в условиях метастатического поражения происходит хуже, это может приводить к нарушению перемещений клеточных элементов иммунной системы в этих участках серозной оболочки. Более плотное расположение коллагеновых фибрилл в участках с наличием метастазов может также являться одной из причин большей адгезии опухолевых клеток в эти участки, подтверждаемое большим количеством клеток с экспрессией одного из маркеров клеточной адгезии CD44.

Анализ экспрессии белка CD44 показал, что выраженная экспрессия этого протеина выявляется в большинстве клеток опухоли и не выявляется в клеточных элементах сальника, в котором отсутствуют метастазы. Одновременно с выраженной экспрессией CD44 в большинстве клеток опухоли обнаруживается экспрессия белков ki67 и P53 (рис. 2, рис. 9-10). Как показал статистический анализ, выраженность экспрессии белка P53 была более значительной, чем экспрессия белка ki67 (рис. 2). Сопоставление результатов, отмеченных выше иммуногистохимических реакций на выявление протеинов (наличие большого числа клеток, экспрессирующих P53 на фоне множества клеток, экспрессирующих ki67, рис. 2) указывает на наличие нарушений регуляторных механизмов программированной клеточной гибели, что отражается и на процессах пролиферации опухолевых клеток. В своей совокупности полученные результаты по экспрессии CD44, ki67 и P53 в клетках метастазов опухоли подтверждают представление о высокой злокачественности низкодифференцированной серозно-папиллярной аденокарциномы яичника.

В ряде работ показано значительное развитие лимфоидной ткани в большом сальнике и обоснована важная роль структур большого сальника в обеспечении иммунных защитных реакций организма [15-19, 24]. Анализ результатов нашего исследования подтверждает наличие значительного числа иммунокомпетентных клеток, преимущественно клеточных элементов, ответственных за клеточный иммунитет, в составе структур большого сальника в области метастазов и в около-опухолевой области, в том числе в составе серозной оболочки органа и на ее поверхности. На это указывает наличие в стенке большого сальника значительного числа клеточных элементов с выраженной экспрессией белков CD7 и CD8 (рис. 2-4).

Заключение. Полученные в настоящем исследовании результаты показывают адаптивные и репаративные возможности структур большого сальника при опухолевом процессе в органах женской репродуктивной системы, указывают на важную роль большого сальника в обеспечении защитных реакций в брюшной полости. В ответ на инвазию опухолевых клеток в большом сальнике активизируются процессы ангиогенеза, неолимфогенеза возрастает численность иммунокомпетентных клеток. Материалы исследования свидетельствуют о значительной пластичности и реактивности большого сальника в условиях опухолевого процесса в организме. Однако, наличие выраженной пролиферативной активности опухолевых клеток в метастазах опухоли указывает на то, что этих адаптивных возможностей недостаточно для противостояния инвазии опухоли в большой сальник.