Ультраструктурные изменения миокарда правого желудочка при адаптации к холодовому стрессу по результатам трансмиссионной и сканирующей электронной микроскопии

Введение. Известно, что холодовое воздействие как стрессовый фактор является пусковым механизмом для развития изменений метаболических процессов в организме. Доказана его роль в этиологии нарушений структуры и функции внутренних органов, в первую очередь сердечно-сосудистой системы [1, 2]. Установлено, что стресс-реакция является необходимым звеном для формирования системного «следа» при адаптации к факторам внешней среды [3]. При действии холодового фактора большое значение имеет состояние биоэнергетики кардиомиоцитов, зависящее от интенсивности транспорта кислорода внутри клетки [4, 5]. Адаптация к короткому стрессу замедляет активацию перекисного окисления липидов и клеточные изменения в миокарде у крыс, а избыток кальция провоцирует повреждающее действие на митохондрии и активацию митохондриальных фосфолипаз [6, 7]. При этом нарушается перенос электронов в митохондриальной цепи из-за разобщенности окислительного фосфорилирования [8]. Однако достоверных изменений миокарда не наблюдается, а адаптация носит устойчивый защитный характер и способна предупредить структурные изменения в кардиомиоцитах, связанные с обеспечением биоэнергетики [9–

13]. В то же время длительный холодовой стресс вызывает снижение растяжимости миокарда, при этом замедляется работа кальциевого насоса, нарастает избыток Са ² в саркоплазме кардиомиоцитов, нарушается функция митохондрий, перегруженных кальцием, существенно снижается синтез аденозинтрифосфата (АТФ) [14, 15].

Цель исследования. Комплексное изучение ультраструктурных изменений кардиомиоцитов правого желудочка и межклеточного матрикса в динамике холодового стресса по результатам сканирующей и трансмиссионной электронной микроскопии.

Материалы и методы. Исследование проведено в Тюменском государственном медицинском университете на кафедре гистологии с эмбриологией им. профессора П.В. Дунаева.

Доставленные из биопитомника «Стезар» (г. Уфа) крысы-самцы линии «Вистар» (n=40) массой 120–150 г были разделены на 2 группы: контрольную и опытную.

Опытных животных протяжении дважды день в течение 30 мин подвергали воздействию низкой температуры (-5...-18 °С). Из эксперимента их выводили на 3-и, 7-е и 15-е сут под общим внутрибрюшинным наркозом Sodium thiopental (0,2 мл на 100 г массы тела).

Для электронно-микроскопического исследования кусочки правого желудочка (1×1 мм) брали из двух отделов: заднего (собственно полости желудочка) и переднего (артериального конуса). Их фиксировали в 2,5 % растворе глутарового альдегида на фосфатном буфере (pH 7,2), дофиксировали в 1 % растворе четырехокиси осмия, контрастировали в 1 % растворе уранилацетата и цитрата свинца. Заливали в блоки контейнера эпоксидной смолой Araldit Harter HY 964, EPON-812 и отвердителем DMP-30 (Switzerland). Ультратонкие срезы толщиной 50 нм готовили на ультрамикротоме LEICA EM UC7 (США). Ультраструктуру кардиомиоцитов исследовали на трансмиссионном электронном микроскопе JEM-1011 (Япония). Для сканирующей электронной микроскопии готовили сколы двух отделов правого желудочка в жидком азоте, напыляли их коллоидным золотом толщиной слоя 20 нм в вакуумной установке HI CUDE (ФРГ). Материал изучали с помощью растрового электронного микроскопа HITACI (Япония). Все биопрепараты были приготовлены в ТюмНЦ СО РАН.

Исследование осуществлялось в соответствии с Международными рекомендациями для медико-биологических исследований с использованием животных (Хельсинки, 1985), Европейской конвенцией по защите позвоночных животных, используемых для экспериментальных и других целей (Страсбург, 1986), Приказом Минздрава России № 199 от 01.04.2016 «Об утверждении правил надлежащей лабораторной практики» и одобрено комитетом по этике ФГБОУ ВО Тюменский ГМУ Минздрава России (протокол № 23 от 17.09.2025). Соблюдены все требования, касающиеся защиты персональных данных [9].

Статистический анализ проведен с использованием программных продуктов StatSoft Statistica 12.0 и IBM StatSoft Statistics Standart (USA).

Для выявления достаточности числа объектов и числа измерений использовали показатель точности опыта, рассчитанный по формуле P=(m/M)×100 %. Достоверными считались различия при p<0,05. Количественные показатели оценивались на предмет нормального распределения с помощью критерия Шапиро – Уилка.

Результаты и обсуждение. Согласно данным сканирующей электронной микроскопии (СЭМ), полученным на 3-и сут после холодового стресса, коллагеновые волокна визуализируются как основной компонент стромы миокарда, формирующий его прочный каркас. Они представляют собой волнистые тяжи, собранные в плотные пучки диаметром 14,4±1,23 мкм, что значительно меньше по сравнению с контролем (табл. 1). Их поверхность выглядит гладкой, а организация в виде трехмерной сети, окружающей группы кардиомиоцитов и связывающей мышечные клетки, обеспечивает механическую прочность и сопротивление растяжению сердечной мышцы (рис. 1).

Таблица 1

Table 1

Морфометрические показатели ультраструктурных компонентов правого желудочка, мкм, М±m,

Morphometric parameters of the right ventricular ultrastructural components, μm, M±m

Параметр Parameters	Контроль Control n=10	Сроки холодового стресса (сут) Duration of cold stress (days)
		3 n=10	7 n=10	15 n=10
Диаметр мышечных волокон правого желудочка Right ventricular muscle fiber diameter	18,6±1,48	14,4±1,23*	16,1±1,05	16,9±1,02
Диаметр ядер правого желудочка Right ventricular nuclear diameter	6,4±0,06	4,1±0,08*	5,2±0,06	5,7±0,07
Диаметр кардиомиоцитов правого желудочка Right ventricular cardiomyocyte diameter	7,1±1,12*	9,7±1,16	7,9±1,16	8,6±1,14

Примечание. * – достоверные отличия от группы контроля, p<0,05.

Note. * – the differences are significant compared with the control group, p<0.05.

Рис. 1. Правый желудочек крысы на 3-и сут воздействия холодового стресса. В межклеточном пространстве видны основные типы волокон матрикса на фоне основного вещества: * – пустая полость, белые стрелки – пучки коллагеновых волокон, черные стрелки – пучки эластических волокон, черно-белая стрелка – ретикулиновые волокна, ^ – капилляры. СЭМ, ×8000

Fig. 1. Right ventricle of rats on day 3 of cold stress. The main types of extracellular matrix fibers are visible against the background of the main substance: * – empty cavity; white arrows – collagen fiber bundles; black arrows – elastic fiber bundles; black-and-white arrow – reticular fibers; ^ – capillaries. SEM, ×8000

Эластические волокна, в отличие от коллагеновых, выглядят как аморфные, ветвящиеся тяжи или пластинки с гладкой и гомогенной поверхностью, которая может иметь слегка пористый рельеф. Эти волокна интегрированы в коллагеновую сеть, часто ассоциируясь с ней, и их главная функция заключается в обеспечении эластичности, которая позволяет миокарду пассивно растягиваться и возвращаться в исходное состояние после сокращения.

Ретикулярные волокна образуют нежную и ажурную трехмерную сеть, служащую тонким опорным каркасом. Под микроскопом они идентифицируются как очень тонкие и гладкие нити. Эта сеть тесно связана с базальными мембранами кардиомиоцитов и капилляров и создает плотную микроопору для паренхимы и сосудистого русла, выполняя роль амортизирующего компонента. Кроме того, в межклеточном пространстве визуали- зируются клетки крови, скопления липопротеидных капель, гранулы Са-содержащего плотного материала (зерна), пространства основного вещества (пустоты) и ретикулярные волокна (рис. 2). Диаметр ядер кардиомиоцитов правого желудочка на 3-и сут холодового воздействия составляет 4,1±0,08 мкм, что значительно отличается от контрольных данных, диаметр кардиомиоцитов – 9,7±1,16 мкм против 7,1±1,12 в контроле (табл. 1).

Рис. 2. Правый желудочек крысы на 3-и сут воздействия холода: * – клетки крови, белые стрелки – скопления липопротеидных капель, черные стрелки – гранулы, # – пространство основного вещества, ^ – коллагеновые волокна. СЭМ, ×8000

Fig. 2. Right ventricle of rats on day 3 of cold exposure: * – blood cells; white arrows – clusters of lipoprotein droplets; black arrows – granules; # – main substance space; ^ – collagen fibers. SEM, ×8000.

По данным трансмиссионной электронной микроскопии (ТЭМ), на 3-и сут наблюдаются конгломерация митохондрий, интерстициальный отек и очаговая деструкция части миофибрилл. Отчетливо видны темные Z-линии, ограничивающие саркомеры друг от друга (рис. 3).

Рис. 3. Правый желудочек крысы на 3-и сут воздействия холодового стресса: черная стрелка – конгломерация митохондрий различных размеров, * – линии Z. ТЭМ, ×20000

Fig. 3. Right ventricle of rats on day 3 of cold stress: black arrow – cluster of mitochondria of various sizes; * – Z-lines. TEM, ×20,000

На 7-е сут холодовой адаптации крыс участок поверхности желудочка покрыт слоем эндотелиальных клеток, для которых характерна черепитчатая архитектура. В центре целостность эндотелиальной поверхности нарушена, на месте разлома видны подлежащие кардиомиоциты диаметром 7,9±1,16 мкм (табл. 1) с межклеточным пространством с сосудами и коллагеновыми волокнами. Визуализируются продольный и поперечный раз- ломы мышечных клеток и коллагеновые волокна. Поперечный разлом кардиомиоцита обрамляют микрофибриллы, представленные объемной ступенчатой структурой. На периферии микрофибрилл между началами Т-тру-бок эндоплазматического ретикулума видны отдельные митохондрии, некоторые из них набухшие и раздвигают фибриллы. На сарколемме кардиомиоцитов видны капилляры (рис. 4).

30 um

Рис. 4. Правый желудочек крысы на 7-е сут холодовой адаптации: # – эндотелиальные клетки, ^ – кардиомиоциты, * – межклеточное пространство, белые стрелки – коллагеновые волокна, черные стрелки – эластические волокна, & – капилляры на сарколемме кардиомиоцитов. СЭМ, ×8000

Fig. 4. Right ventricle of rats on day 7 of cold adaptation: # – endothelial cells; ^ – cardiomyocytes; * – extracellular matrix; white arrows – collagen fibers; black arrows – elastic fibers; & – capillaries on the cardiomyocyte sarcolemma. SEM, ×8000

Кроме того, наблюдаются пучки коллагеновых волокон, имеющих характерную продольную извитость и относительно гладкую поверхность (рис. 5). На их фоне, а также непосредственно на поверхности визуализируются многочисленные сферические образования (глобулы, скопления солей кальция) разных размеров с высокой электронной плотностью. Данные структуры хаотично расположены вдоль оси волокон, сливаясь в более крупные конгломераты. Коллагеновые волокна в зоне кальцификации теряют четкость контуров и фибриллярную структуру. На поверхности поперечного разлома кардиомиоцитов между клетками видны фрагменты капилляров, глобулы кальция. Диаметр мышечных волокон правого желудочка составляет 16,1±1,05 мкм; диаметр ядер 5,2±0,06 мкм (табл. 1).

Рис. 5. Правый желудочек крысы на 7-е сут воздействия холодового стресса: # – пучки коллагеновых волокон, черные стрелки – глобулы, скопления солей кальция, белая стрелка – капилляр с признаками варикозного изменения, * – поверхность поперечного разлома кардиомиоцитов. СЭМ, ×8000

Fig. 5. Right ventricle of rats on day 7 of cold stress: # – collagen fiber bundles; black arrows – globules, calcium salt deposits; white arrow – capillary showing signs of varicose-like changes; * – transverse fracture surface of cardiomyocytes. SEM, ×8000

По данным ТЭМ, в кардиомиоцитах наблюдаются осмиофильные липидные капли с солями осмия (OsO₄), а так как осмий очень тяжелый металл и сильно рассеивает электроны, на микрофотографиях липидные капли выглядят идеально черными, гомогенными и резко контра- стирующими с более светлой цитоплазмой. Они располагаются в цитоплазме, зачастую вытесняя и отодвигая на периферию другие органеллы (митохондрии, элементы эндоплазматического ретикулума), и выстраиваются цепочками между миофибриллами и вокруг ядра (рис. 6).

Рис. 6. Правый желудочек крысы на 7-е сут воздействия холода: черная стрелка – осмиофильные липидные капли. ТЭМ, ×25000

Fig. 6. Right ventricle of rats on day 7 of cold exposure: black arrow – osmiophilic lipid droplets. TEM, ×25000

Через 15 сут холодового стресса, согласно результатам СЭМ, поверхность сосудов, пучков кардиомиоцитов и коллагеновых волокон покрыта конгломератами солей кальция, что вызывает повреждения – от внутриклеточного ме- таболического криза (липидные капли) и межклеточного рубцевания (фиброз) до системной минерализации, затрагивающей и внутреннюю выстилку органа. Видны пучки коллагеновых волокон перимизия (рис. 7).

Рис. 7. Правый желудочек крысы на 15-е сут холодового воздействия: черная стрелка – поверхность сосудов, * – пучки кардиомиоцитов, белая стрелка – коллагеновые волокна; + – соли кальция, черно-белые стрелки – пучки коллагеновых волокон перимизия, # – поверхность пучков кардиомиоцитов. СЭМ, ×6000

Fig. 7. Right ventricle of rats on day 15 of cold exposure: a) black arrow – vessel surface; * – cardiomyocyte bundles; white arrow – collagen fibers; + – calcium salts; black-and-white arrows – perimysial collagen fiber bundles; # – surface of cardiomyocyte bundles. SEM, ×6000

Согласно данным ТЭМ в зоне вставочного диска межклеточные контакты десмо-сом представлены в виде пятен слипания липосом. В нижней части видны поперечные срезы компонентов миофибрилл. Наблюдаются проявления отека – набухания митохондрий с шероховатой эндоплазматической се- тью со множеством мелких рибосом, выстроенных цепочкой (рис. 8). Диаметр мышечных волокон правого желудочка составляет 16,9±1,02 мкм, диаметр ядер кардиомиоцитов правого желудочка – 5,7±0,07 мкм, диаметр кардиомиоцитов правого желудочка – 8,6±1,14 мкм (табл. 1).

Рис. 8. Правый желудочек крысы на 15-е сут воздействия холодового стресса: белая стрелка – десмосома, черная стрелка – митохондрия, * – шероховатая эндоплазматическая сеть;

v – липидные капли. ТЭМ, ×25000

Fig. 8. Right ventricle of rats on day 15 of cold stress: white arrow – desmosome; black arrow – mitochondrion; * – rough endoplasmic reticulum; v – lipid droplets. TEM, ×25000

Таким образом, была предпринята попытка выявить целостную картину ремоделирования миокарда правого желудочка под действием холодового стресса. Сочетание ультраструктурных признаков фиброза, жировой дистрофии и кальцификации указывает на многоуровневые изменения в сердечной мышце крыс линии «Вистар». Вероятно, уже через 3-е сут холодового воздействия запускается каскад изменений, ведущих к прогрессирующему диффузно-очаговому разрушению архитектоники миокарда по нескольким взаимосвязанным структурно-функциональным системам. Эти процессы не изолированы, они тесно переплетены и усугубляют друг друга [16, 17].

В ответ на гибель кардиомиоцитов активируются фибробласты. Они начинают синтезировать коллаген, пытаясь «залатать» повреждение. Изначально это адаптивная реакция, но при хроническом стрессе она становится избыточной, что приводит к разрастанию коллагеновой сети, а изоляция оставшихся жизнеспособных кардиомиоцитов, вероятно, нарушает их координацию.

Погибающие клетки теряют способность поддерживать внутриклеточный градиент кальция, ионы поступают в клетку и в межклеточное пространство, а незрелые коллагеновые волокна и мембранные везикулы погибших клеток служат матрицей для осаждения кристаллов фосфата кальция. Сочетание фиброза и кальцификации указывает на то, что нормальная сердечная поперечно-полосатая мышечная ткань в этом месте будет замещена рубцовой и минерализованной матрицей [18–20].

Заключение. Таким образом, холод вызывает спазм сосудов и нарушение микроциркуляции, что приводит к кислородному голоданию кардиомиоцитов. В таких условиях митохондрии не могут эффективно окислять жирные кислоты. Нарушается энергетический метаболизм, и жиры начинают накапливаться внутри и вне клеток. В результате кардиомиоциты функционируют хуже, их сократительная способность снижается.

Холодовой стресс приводит к окислительному, в результате чего повреждаются мембраны клеток и внутриклеточные структуры. Это может приводить к гибели кардиомиоцитов, являющейся ключевым триггером для других процессов, а отложение солей кальция создает участки с нарушенной проводимостью, способствуя возникновению эктопических очагов возбуждения. Данные процессы представляют собой маркеры прогрессирующей сердечной недостаточности и подобное ремоделирование при холодовом стрессе снижает насосную функцию правого сердца (систолическая и диастолическая дисфункция).