Ультразвуковая дезинтеграция микроорганизмов с использованием волокнистого наполнителя

Одной из задач дезинтеграции микроорганизмов на ультразвуковом дезинтеграторе с использованием волокнистого наполнителя камеры дезинтегратора является полное исключение кавитации, которая приводит к дополнительному химическому воздействию на биологические структуры, вероятно, механической природы (микрокрекинг макромолекул, образование свободных радикалов и др.), включая намол материала сосудов, в которых проводят дезинтеграцию микроорганизмов.

Исследования показали, что при определенных отношениях суммарной поверхности волокнистого наполнителя к объему озвучиваемой суспензии микроорганизмов кавитация полностью подавляется даже при сравнительно высоких интенсивностях ультразвука. Одновременно возрастает интенсивность акустических течений [1]. Возрастают эффективность дезинтеграции микроорганизмов (увеличивается процент разрушенных клеток) и выход белка.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Клетки Esherihia coli были выращены в минеральной среде. В логарифмической фазе роста клетки были отделены центрифугированием на 5000 об/мин в течение 10 мин, дважды промыты раствором 0.14 моль NaCl в 0.01 моль трис-НСl буфере, рН 7.5, cодержащем 0.01 моль MgCl 2 при температуре 4 °С. Для дезинтеграции клеток использовалась их суспензия в 0.01 моль трис-HCl буфере, рН 7.5,содержащая 0.01 моль MgCl 2 .

Клетки Methylocystis echinoides выращены на минеральной среде в атмосфере метан—воздух (1:1) до середины экспоненциальной фазы при температуре 30 °С.

Состав среды, г/л:

KNO 3 — 1; KH 2 PO 4 — 0.7; Na 2 HPO 4 ·12H 2 O — 1.3; MgSO 4 — 0.2; CaCl 2 — 0.02.

Микроэлементы — 1 мл/л.

Состав микроэлементов, г/л:

трилон Б — 5.0;

FeSO 4 ·7H 2 O, ZnSO 4 ·7H 2 O, MgCl 2 ·4H 2 O — 0.03;

CaCl 2 ·6H 2 O — 0.2; CuCl 2 ·6H2O — 0.01;

NiCl 2 ·6H 2 O — 0.02; NaMnO 4 — 0.03.

Вода дистиллированная — 1 л.

Клетки центрифугировались на частоте вращения 5000 об/мин и отмывались калий-фосфатным буфером 0.05 моль, рН 7.5.

Дальнейшие условия одинаковы для обеих культур.                                 ₉

• ■    Концентрация суспензии — 15^10 9 клт./мл.

• ■    Объем дезинтегрируемой суспензии — 60 мл.

• ■    Режим протока — циркуляция.

• ■    Объемный расход суспензии — 60 мл/мин.

• ■    Время дезинтеграции — 10 мин.

• ■    Температура суспензии поддерживалась в пределах от 2 до 8 °С.

• ■    Частота колебаний наконечника — 22 кГц, амплитуда — 14÷16 мкм, мощность дезинтеграции — 100 Вт.

Дезинтеграция проводилась в специальной камере, конструкция которой описана ниже. Камера была заполнена волокнистым наполнителем (рис. 1). Волокнистый наполнитель представляет собой стеклянные волокна диаметром 8–12 мкм с силированной поверхностью, 0.1–0.7 от объема камеры.

Для сравнения проводилась дезинтеграция суспензий этих же культур при аналогичных условиях, но без наполнителя. Определялась оптическая плотность исходных суспензий и дезинтеграта. Концентрация клеток рассчитывалась по калибровочным кривым.

Рис. 1. Схема установки для ультразвуковой дезинтеграции в камере с волокнистым наполнителем.

1 — ультразвуковой генератор; 2 — концентратор; 3 — наконечник; 4 — камера; 5 — волокнистый наполнитель

Процент разрушения клеток определялся фотометрическим способом. Определения концен-

трации белка в дезинтеграте и активности ферментов в супернатанте производились после центрифугирования дезинтеграта в течение 10 мин. Белок определялся по методу Лоури [2].

Активность NН 4 -зависимых дегидрогеназ метанола и формальдегида, NН 4 -независимых дегидрогеназ формальдегида и формиата определялась по восстановлению 2.6-дихлорфенолиндофенола на 600 нм [3].

Активность NAD-зависимой формиатдегидрогеназы определялась по восстановлению NAD на 300 нм [4].

Активность NADН-оксидазы определялась по окислению NADН на 340 нм [3].

Активность сукцинатдегидрогиназы определялась по восстановлению дихлорфенолиндофенола на 600 нм [5].

Активность АТФ определялась по скорости восстановления АТФ до АДФ и ортофосфата. Ортофосфат определялся по методу Беренблюма и Чейна [6] в модификации Грина [7].

Проверка влияния волокнистого наполнителя на потребляемую при дезинтеграции мощность проводилась в камере вместимостью 50 мл. Проток воды, имитирующий суспензию микроорганизмов, — 70 мл/мин; температура воды — 4 °С.

Для сравнения проводилось озвучивание воды при указанных выше условиях, но без наполнителя (контрольный опыт).

Табл. 1. Результаты дезинтеграции клеток Methylocystis echinoides

Характеристика		Способ дезинтеграции
		Без наполнителя	С волокнистым наполнителем
Выход белка (по Лоури), мг/мл		0.1	0.36
Эффективность дезинтеграции, %		6	19
Активность ферментов, МЕ/мг белка/мин	Метанолдегидрогеназа	0	15
	Формальдегиддегидрогеназа	0	14
	Формиатдегидрогеназа (NAD)	0	143
	Формиатдегидрогеназа (ФМС)	23	183
	Сукцинатдегидрогеназа	0	9

Табл. 2. Результаты дезинтеграции клеток Escherihia coli

Способ дезинтеграции	Эффективность дезинтеграции, %	Белок (по Лоури)	Активность АТФ, МЕ/мг белка/ мл
Без наполнителя	47	0.34	77.8
С волокнистым наполнителем	56	0.55	86.6

Рис. 2. График зависимости мощности от амплитуды колебаний наконечника.

I — камера с волокнистым наполнителем; II — камера без наполнителя

ОБОРУДОВАНИЕ И ПРИНАДЛЕЖНОСТИ

Используемые приборы: спектрофотометры ФЭК-60П, СФ-16 (изготовитель СССР), Spekord UV VIS (изготовитель ГДР); исследовательский биологический микроскоп Биолам И-1 (ЛОМО).

Исследования были проведены на ультразвуковом дезинтеграторе микроорганизмов UDM-10, разработанном приборостроительной фирмой Tehpan (Польша). Дезинтегратор оснащен устройством термостатирования и протока жидкости

УТП, поддерживающим заданный предел температур в камере дезинтегратора и время дезинтеграции, разработанным в ИБП РАН (НПО "Биоприбор" АН СССР).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Результаты дезинтеграции приведены в табл. 1 и 2. Влияние волокнистого наполнителя на потребляемую мощность показано на графике рис. 2).

Проведение ультразвуковой дезинтеграции в камере с волокнистым наполнителем показывает, что при уменьшенной в 2 раза амплитуде колебаний вибратора (8 мкм), эффективность дезинтеграции возрастала в 1.2–3 раза. При этом мощность оставалась на одном уровне с контрольными опытами (без наполнителя), а выход белка увеличивался в 1.5 раза. Для клеток с более прочными оболочками эффективность использования волокнистого наполнителя еще выше.

Использование при дезинтеграции волокнистого наполнителя приводит к снижению мощности в 1.2–3.5 раза по сравнению с контролем. И чем меньше амплитуда колебаний вибратора, тем больше снижается мощность за счет использования волокнистого наполнителя.