Универсальный метод элективного выявления аргирофильных структур

Введение. Современная гистологическая техника имеет под собой прочные теоретические основы из различных смежных наук. Традиционные же методы исследования, которыми в настоящее время продолжают пользоваться анатомы и гистологи, по-прежнему во многом остаются эмпирическими. В первую очередь, это касается импрегнации нервной ткани и микрососудистого русла серебром. Для импрегнации серебром сосудистой стенки на протяжении многих лет используется классический метод Ранье-Гойера. Внутрисосудистое введение слабых растворов нитрата серебра устраняет проблему конкурентной аргирофилии тканей и позволяет исследовать ми-крососудистое русло на значительных по площади препаратах. Однако широкого применения метод не получил, поскольку он дает относительно хорошие результаты только в суправительных тканях. Иммерсионные способы импрегнации сосудистой стенки реализуются в методах Е.И.Рассказовой и В.В.Куприянова, которые в свою очередь являются разными модификациями классического нейроги-стологического метода Бильшовского-Грос. Практическое применение методов иммерсионной импрегнации ограничено резко выраженным феноменом конкурентной аргирофилии различных тканей. В связи с этим импрегнация микрососудов по В.В.Купрянову [1] удается только в пленочных препаратах. Кроме того, тотальная импрегнация клеток и фиброосновы сосудистой стенки не позволяет дифференцировать детали структуры эндотелия, перицитов и гладких миоцитов, поскольку импрегнируются только их ядра.

Цель исследования – разработка универсального метода выявления аргирофильных

Рис. 1. Нейроциты миентерального нервного сплетения тонкой кишки кошки. Универсальный метод импрегнации серебром. Ув.400.

Рис. 2. Лимфатические микрососуды продольного слоя мышечного оболочки тонкой кишки кошки. Универсальный метод импрегнаии серебром. Ув. 200.

Рис. 3. Артериола и интерстициальные клетки продольного слоя мышечной оболочки тонкой кишки кошки. Универсальный метод импрегнации серебром. Ув. 900.

Рис. 4 Нейроцит и клетки-сателлиты ганглия миентерального нервного сплетения тонкой кишки кошки. Универсальный метод импрегнации серебром. Ув.900.

структур, в том числе нервных и сосудистых.

Материал и методы исследования. От метода и степени владения им зависит качество гистологических препаратов, а так же ценность и научная достоверность выявленных исследований и полученных результатов. Для достижения поставленной цели был разработан универсальный метод, базирующийся на классических импрегна-ционных методах: интрасосудистом – Ранье-Гойе-ра и иммерсионном – Бильшовского-Грос. Метод апробирован на лабораторных животных: кошках (n=11), собаках (n=15), белых крысах (n=17). Содержание животных и их эвтаназия осуществляются в соответствии с Директивой ЕС «О защите животных, используемых в экспериментальных и научных целях» (86/609 СЕ) и согласно соответствующему законодательству РФ. Животным, находящимся под эфирным наркозом, каюлиро-вали брюшную аорту и пересекали воротную вену. Через брюшную аорту вначале перфузировали 5% раствор глюкозы до появления в воротной вене чистого перфузата [2, 3 ]. Затем перфузировали раствор гидроокиси бария [Ва (ОН)₂], который является физиологическим трассером, переходящим из кровеносного русла через интерстициальное пространство в лимфатические микрососуды. Аргифилия тканевых структур определяется уровнем рН осаждения гидроокиси серебра из раствора его азотнокислой соли. Полное осаждение происходит при рН 11-13 [4]. Попадая в просвет лимфатических микрососудов, где рН резко возрастает до 9, раствор гидроокиси бария дает осадок на сосудистой стенке, повышая тем самым ее аргифилию.

Раствор гидроокиси бария готовится заранее на основе 5% раствора глюкозы, который насыщается плохо растворимым гидроокисями кальция и магния. Затем в 1 литр раствор добавляется 1,5 г гидроокиси бария. Через 3-5 мин после перфузии раствора через брюшную аорту – воротную вену, производится забор исследуемого материала и фиксация его в 15% аметанольном формалине, нейтрализованном тетраборнокислым натрием (0,5 г на 1 л раствора). Эмпирически определяется оптимальный срок фиксации материала путем пробной его импрегнации через каждые 2-е суток. Дальнейшие манипуляции проводятся по классической методике Бильшовского-Грос. Тотальные препараты толщиной до 300 мкм ополаскиваются дистиллированной водой, сушатся на фильтре, а затем помещаются в раствор нитрата серебра (от 1 до 10%).

Концентрация первого серебра и экспозиция его на препарате определяется опытным путем в каждом конкретном случае. Благодаря гидроокисям Мg++ и Ва++ кровеносные и лимфатические микрососуды приобретают такую же аргирофилию, как и вегетативные нервные волокна и нейроциты. После первого серебра, как требует классический метод Бильшовского-Грос, материал переносится в аммиачное серебро, концентрация и экспозиция которого на препарате определяется так же опытным путем. Универсальный метод импрегнации оказался результативным, поскольку в его основу положен нанотехнологический принцип искусственного целенаправленного изменения прижизненных свойств нервных и микрососуди-стых структур. Представленный иллюстративный материал получен универсальным методом импрегнации продольного слоя мышечной оболочки и миентерального нервного сплетения тонкой кишки кошки. Микрофотографии (рис. 1-4) выполнены с одного препарата толщиной – 300 мкм и площадью 24 см2 на микроскопе «Leica-DM 1000» с видеосистемой.