Упреждающая селекция: использование молекулярных маркеров при создании доноров устойчивости картофеля (Solanum tuberosum L.) к фитофторозу на основе сложных межвидовых гибридов

Фитофтороз (возбудитель — оомицет Phytophthora infestans Mont. de Bary) остается важнейшей в экономическом отношении болезнью картофеля: ежегодно с ней связаны потери не менее 15 % урожая, а глобальный экономический ущерб, включая расходы на химическую борьбу с патогеном, оценивается в 10 млрд долларов США (1). Эпидемии фитофтороза,

^∗ Работа выполнена при финансовой поддержке МНТЦ (проект ¹ 3714п), РФФИ (проекты ¹ 13-0400163/14, ¹ 14-04-31613а и ¹ 16-04-00098) и Министерства образования и науки Российской Федерации (Госконтракт ¹ 16.М04.12.0007). Получение межвидовых гибридов картофеля, фитопатологическая оценка изолятов Phytophthora infestans , оценка устойчивости картофеля к фитофторозу и маркерный анализ генотипов картофеля выполнены в рамках Государственных заданий 0662-2014-0018, 0598-2015-0018, 0598-20150016 и 0574-2014-0020.

вызванные появлением новых рас P. infestans вследствие эволюции и миграции патогена, периодически уничтожают до 70-100 % урожая (2-4). Поэтому для устойчивого картофелеводства требуются сорта с долговременной (durable) высокой устойчивостью к широкому кругу рас P. infestans , гарантирующей существенное сохранение продуктивности растений при изменении расового состава патогена в агроценозе. Создание таких сортов можно назвать упреждающей селекцией.

Определяющую роль в этой стратегии играют источники устойчивости к P. infestans — виды Solanum L. (секция Petota Dumort.). Гены устойчивости найдены у многих представителей рода Solanum из Северной и Южной Америки (5), но лишь небольшое их число имеется у коммерческих сортов картофеля . Одним из первых примеров интрогрессии таких расоспецифичных генов вертикальной устойчивости (R генов) от дикорастущего вида было создание межвидовых гибридов на основе S. demissum (6, 7), но достигнутая таким образом устойчивость быстро преодолевалась новыми расами P. infestans (8). Горизонтальная устойчивость к фитофторозу (8-10), присущая широкому кругу клубненосных видов Solanum, контролируется многочисленными расонеспецифичными генами. В значительной мере они картированы только как локусы количественных признаков (QTL) и исследованы значительно слабее, чем расоспецифичные гены (5, 11, 12). То обстоятельство, что проявление расонеспецифичных генов сильно зависит от внешних факторов, серьезно усложняет работу по селекции на горизонтальную устойчивость к фитофторозу.

Привлечение генетических источников для создания доноров селекционно ценных признаков происходит на этапе предбридинговой селекции. Во Всероссийском институте генетических ресурсов растений им. Н.И. Вавилова (ВИР, г. Санкт-Петербург) собрана одна из крупнейших мировых коллекций культурных и дикорастущих клубненосных видов Solanum , установлены генетические центры формирования фитофтороустойчивых видов (13), разработаны генетические основы получения межвидовых гибридов-доноров (14) и отбора образцов, пригодных для межвидовой гибридизации.

Сложные межвидовые гибриды с генетическим материалом сразу нескольких дикорастущих видов Solanum могут стать лучшими донорами для создания устойчивых сортов картофеля (10, 15, 16), а пирамидирование (объединение) разных генов устойчивости к фитофторозу в одном растении делает эту устойчивость долговременной. Как правило, дикорастущие сородичи картофеля и гибриды с их участием содержат по несколько R генов разной расоспецифичности (17), для распознавания которых традиционно используют наборы рас P . infestans , у которых факторы вирулентности установлены с помощью сортов-дифференциаторов Мастен-брока-Блека (7, 18). Эти расы-дифференциаторы выявляют только 11 R генов S . demissum (причем далеко не все из них клонированы) и не распознают другие гены, которые могут присутствовать у видов Solanum . У части таких растений-дифференциаторов имеется более одного R гена (19), а у рас-дифференциаторов P . infestans ген авирулентности ipiO , опознающий ген RB / Rpi-blb1 у картофеля, характерный для S . bulbocastanum , но отсутствующий у S . demissum (20), представлен двумя классами.

Многие подобные затруднения были преодолены благодаря созданию моногенных растений-дифференциаторов (21). Но и в этом случае использование рас P. infestans с известными генами вирулентности, вероятно, не даст ту же точность идентификации R генов, какую обеспечивает их прямое обнаружение с помощью молекулярных маркеров. Таким образом, эффективный поиск генов устойчивости, специфичных в отношении ши- рокого круга рас P. infestans, и их пирамидирование опираются в первую очередь на молекулярное маркирование.

Для обследования больших генетических коллекций и контроля результатов на этапах селекции наиболее удобны маркеры, которые представляют собой фрагменты самих генов устойчивости. Такие SCAR (sequence characterized amplified region) маркеры, в отличие от фланкирующих маркеров, полностью сохраняют информативность даже при значительной рекомбинации генетического материала в геномах гибридов. Основная проблема, возникающая при использовании этих маркеров, заключается в необходимости различать функционально активные гены и их неактивные структурные гомологи. Отметим, что более специфичное распознавание R генов устойчивости у растения обеспечивают методы эффекторомики (22): индивидуальные гены авирулентности патогена ( Avr гены) вводят в растение в составе вектора, и хорошо наблюдаемая реакция сверхчувствительности свидетельствует о присутствии соответствующего R гена. Этот методический подход тоже имеет ограничения, и лучшие результаты достигаются при сочетании двух взаимодополняющих технологий.

В настоящей работе мы впервые систематизировали данные многолетнего изучения коллекций сложных межвидовых гибридов и сортов картофеля, входящих в родословные таких гибридов либо используемых как стандарты при оценке устойчивости к фитофторозу (частично результаты представлялись ранее на рабочих совещаниях Европейской сети исследователей фитофтороза — EuroBlight Workshops, 2013, 2015; . Сделанное обобщение позволило нам предложить новый подход к получению сортов с длительной устойчивостью к фитофторозу. Этот подход основан на создании методами направленной интрогрессивной селекции сложных межвидовых гибридов картофеля, высокая устойчивость которых к фитофторозу достигнута благодаря пирамидированию R генов устойчивости под контролем молекулярных маркеров этих генов. Большой пул таких гибридов, используемых в качестве селекционных доноров, позволяет оперативно реагировать на изменения в составе популяции патогена.

Ниже мы проиллюстрируем применение подхода, ориентированного на упреждающую селекцию, и связанные с ним затруднения на примере двух групп межвидовых гибридов.

Методика . Исследовали 10 сортов (Alpha, Desiree, Bintje, Early Rose, Eesterling, Escort, Gloria, Елизавета, Свитанок киевский и Sarpo Mira), дигаплоид сорта Atzimba и 39 клонов сложных межвидовых гибридов картофеля, полученных во Всероссийском НИИ картофельного хозяйства им. А.Г. Лорха (Московская обл.), Всероссийском институте генетических ресурсов растений им. Н.И. Вавилова (ВИР, г. Санкт-Петербург) и Всероссийском НИИ защиты растений (г. Санкт-Петербург) с участием 16 клубненосных видов Solanum из разных центров происхождения.

Устойчивость листьев к фитофторозу оценивали в многолетних полевых опытах в двух регионах России — Северо-Западном (ВИР) и Центральном (Всероссийский НИИ фитопатологии, ВНИИФ) при естественном заражении. Стандартами служили сорта Елизавета, Удача, Наяда и Петербургский (ВИР) или Alpha, Bintje, Eesterling, Escort, Gloria, Robijn и Sarpo Mira (ВНИИФ). В лабораторных опытах отделенные листья растений, выращенных в теплице, заражали высоковирулентным и агрессивным изолятом P . infestans (расы 1-11) из коллекции ВНИИФ, используя в качестве стандарта сорт Sant e (23).

Геномную ДНК выделяли из молодых листьев с помощью набора AxyPrep™ Multisource Genomic DNA Miniprep Kit («Axygen Biosciences», 86

США). Концентрацию ДНК измеряли при λ = 260 нм на нанофотометре UV/Vis NanoPhotometer P300 («IMPLEN», Германия). Методы амплификации геномной ДНК, клонирования и секвенирования ампликонов описаны нами ранее (24). ПЦР проводили в амплификаторе DNA Engine PTC-200 («Bio-Rad», США) с 1,0 ед. Taq ДНК-полимеразы («Fermentas», США), а в случае маркера R2-2500 — с 2,5 ед. Pfu ДНК-полимеразы («Fermentas», США). Для элюирования целевых фрагментов ДНК использовали набор QIAquick Gel Extraction Kit («Qiagen N.V.», Германия), для клонирования — pGEM-T Easy Vector System I («Promega», США); в случае маркера R22500 применяли набор Thermo Scientific™ CloneJET™ PCR Cloning Kit и вектор pJet («Fermentas», США). Секвенирование выполняли с помощью анализаторов ABI PRISM 3130xl («Applied Biosystems», США) или Нанофор 05 («Институт аналитического приборостроения РАН», Россия). Праймеры были синтезированы ЗАО «Синтол» (Россия). Секвенированные фрагменты собирали с помощью пакета SeqMan, Lasergene 7.0 (доступно по .

Анализ корреляций выполняли в программе Statistica 6.0 («StatSoft Inc.», США; доступна на , оценивая параметрическую корреляцию по Пирсону, ранговую корреляцию по Спирмену, а также используя непараметрический критерий Вилкоксона. Все коэффициенты корреляции были значимыми на уровне p < 0,05.

Результаты . Работа с клоновыми коллекциями гибридов и сортов картофеля (15), которые поддерживаются в ВИР и ВНИИФ, позволяет сравнивать результаты независимых испытаний в нескольких лабораториях и существенно повышает воспроизводимость экспериментов. Каждый из изученных нами межвидовых клонов несет генетический материал разных источников устойчивости к фитофторозу и имеет в родословной от 2 до 8 дикорастущих видов картофеля (их значительная часть представлена ниже).

В полевых условиях при естественном заражении P . infestans большинство изученных клонов межвидовых гибридов из года в год проявляли высокую устойчивость к фитофторозу, сопоставимую с таковой у эталонного сорта Sarpo Mira (8 баллов). Высокую устойчивость клонов (до 7 баллов) регистрировали и в лабораторных исследованиях.

Различия в результатах полевого испытания и лабораторного теста (1-3 балла) для подавляющего большинства клонов гибридов и сортов картофеля можно объяснить более благоприятными условиями для развития патогена в лабораторном тесте (3) и вкладом других органов растения в общую устойчивость (25). Там, где эти различия особенно велики, можно также ожидать заметной активности расонеспецифичных генов устойчивости. Показатели полевой и лабораторной устойчивости тесно связаны (коэффициент корреляции Пирсона 0,963 значим при p < 0,01).

Для скрининга мы отобрали хорошо верифицированные SCAR маркеры шести R генов расоспецифичной устойчивости к фитофторозу, которые локализованы на шести из 12 хромосом картофеля: R1 (5-я хромосома), R2 / Rpi-blb3 (4-я хромосома), R3a и R3b (11-я хромосома), RB / Rpi-blb1 = Rpi-sto1 (8-я хромосома) и Rpi-vnt1.3 (9-я хромосома) (табл. 1). Эти маркеры были сконструированы для R генов устойчивости к фитофторозу, исходно охарактеризованных у четырех видов Solanum — S . bulbocastanum , S . demissum , S . stoloniferum и S . venturii .

Для иллюстрации результатов скрининга мы отобрали две контрастные группы генотипов картофеля (табл. 2): гибриды, у которых высокой устойчивости к фитофторозу соответствует присутствие 3-4 маркеров R генов устойчивости (такие формы составляют большинство исследован- ных нами межвидовых гибридов) и гибриды с высокой устойчивостью и малым числом маркеров.

1.    Характеристика SCAR (sequence-characterized amplified region) маркеров R генов устойчивости картофеля (Solanum L.) к фитофторозу, использованных в работе Ген Маркер с указанием длины (-п.н.) Температура отжига, °С Прямой (F) и обратный (R) праймеры (5'^3') Ссылка Rpi-blb1 Rpi-blb1-820 62 F: AACCTGTATGGCAGTGGCATG R: GTCAGAAAAGGGCACTCGTG (27) Rpi-sto1 = Rpi-blb1 Rpi-sto1-890 65 F: ACCAAGGCCACAAGATTCTC R: CCTGCGGTTCGGTTAATACA (28) R1 R1-1205 65 F: CACTCGTGACATATCCTCACTA, R: GTAGTACCTATCTTATTTCTGCAAGAAT (24) R2 R2-2500 62 F: ATGGCTGATGCCTTTCTATCATTTGC R: TCACAACATATAATTCCGCTTC (19) R3a R3-1380 64 F: TCCGACATGTATTGATCTCCCTG R: AGCCACTTCAGCTTCTTACAGTAGG (24) R3b R3b-378 64 F: GTCGATGAATGCTATGTTTCTCGAGA R: ACCAGTTTCTTGCAATTCCAGATTG (29) Rpi-vnt1.3 Rpi-vnt1.3-612 65 F: CCTTCCTCATCCTCACATTTAG R: GCATGCCAACTATTGAAACAAC (30) 2.    Распределение SCAR (sequence-characterized amplified region) маркеров R генов в двух группах межвидовых гибридов картофеля (Solanum L.) разного происхождения с высокой устойчивостью к фитофторозу Генотип Маркер Число Устойчивость, балл Дикие виды 1   2   3   4   5   6   7 маркеров полевая лабораторная в родословной

	Ги	бриды	с	известными R	генами	устойчивости
2372-60	1	0    1	1	0   0   0       3	8	6,0      adg, chc, dms, sto
12/1-09	0	1    0	0	1    1    0        3	7	6,0      adg, dms, mcd, plt = sto,
15/13-09	0	1    0	1	1    0    0        3	6	pnt, sto, vlm 6,0      adg, dms, mcd, plt = sto,
16/27-09	1	0   0	0	1    1    0        3	7	sto, vlm 7,0      adg, ber, dms, mcd, phu,
111 (38 КВА)	0	0    1	1	1    1    0        4	7	plt = sto, sto, vlm 6,5      adg, dms, mcd, plt = sto,
39-1-2005	0	0   0	1	1    0    1         3	7	sto 6,0      aln, dmsа, б
134-6-2006	0	0    1	1	0   0    1        3	6	5,0      aln = brcб
139	1	0   0	0	1    1    0        3	9	6,0      adg, aln, ber, dms, mcd,
135-1-2006	0	1     1	1	0   0    1        4	7	plt = sto, pnt, sto, vlm 5,0      aln = brcб
	Гибриды,		предположительно несущ			ие неизвестные
2585-80	1	0   0	1	гены устой 0   0   0       2	чивости 7	6,0     dms
2585-67	0	0    1	1	0   0   0       2	7	6,0     dms
106 (171-3)	0	0   0	1	0   0    0        1	7	6,0      adg, dms, ryb
113 (50/1 КВА)	0	0   0	0	0   0   0       0	7	6,0      adg, dms, phu, sto, vrn и
118 (118-5)	0	0    1	1	0   0   0       2	8	смесь пыльцы гибридов 6,0      adg, dms, ryb
24-1	0	0   0	1	0   0    1        2	8	6,5      aln = brcб
134-2-2006	1	0   0	0	0   0    1        2	7	6,0      aln = brcб
Дигаплоид сорта Atzimba	0	0   0	0	0   0   0       0	7	Нет данных Не известны
Примечание. 1		— R1-1205, 2		— R2-2500, 3 — R3a-	1380, 4 — R3b-378, 5 — Rpi-blb1-820, 6 — Rpi-sto1,

7 — Rpi-vnt1.3; а — неясен источник маркера Rpi-blb1-820, б — неясен источник маркера Rpi-vnt1.3; adg —

S. andigenum , aln — S. alandiae , ber — S. berthaultii , brc — S. brevicaule , chc — S. chacoense , dms — S. demissum , mcd — S. microdontum , phu — S. phureja , plt — S. polytrichon = S. stoloniferum , pnt — S. pinnatisectum , ryb — S. rybinii = S. phureja , sto — S. stoloniferum , vlm — S. vallis-mexiсi , vrn — S. vernei .

Примененные нами маркеры были сконструированы для R генов устойчивости к фитофторозу, исходно охарактеризованных у четырех видов Solanum — S. bulbocastanum , S. demissum , S. stoloniferum и S. venturii . Сравнение клонов межвидовых гибридов картофеля с дикорастущими видами Solanum , использованными при создании этих гибридов (24, 26), подтвердило, что состав R генов у гибридов в основном соответствовал их родословным. Маркеры генов R1 , R2 , R3a и R3b с наибольшей вероятностью перенесены из S . demissum , однако, как показал скрининг обширной 88

коллекции дикорастущих видов из секции Petota (24), их источником могли быть и другие дикорастущие виды, отмеченные в родословных. Генетический материал S . bulbocastanum не использовали в создании исследованных гибридов, и там, где мы находим маркер гена Rpi-blb1 , он был перенесен из S . stoloniferum — тетраплоидного вида, один из геномов которого, по всей видимости, происходит от S . bulbocastanum (27). Неплохо согласуются результаты скрининга с маркерами Rpi-blb1-820 и Rpi-sto1-890, которые соответствуют двум далеко отстоящим друг от друга участкам гена Rpi-blb1 = Rpi-sto1 . Присутствие гена R1 у S . stoloniferum подтверждено подробными исследованиями этого вида (31), в том числе клонированием полноразмерного ортолога R1 (GenBank accession number KU302613, National Center for Biotechnology Information — NCBI, США); кроме того, присутствие функционального гена R1 у S . stoloniferum засвидетельствовано методом эффекторомики (32).

В некоторых случаях мы не можем интерпретировать полученные данные без дальнейших углубленных исследований. Это относится к маркерам Rpi-blb1-820 и Rpi-sto1, присутствовавшим у гибридов, в родословных которых не значился вид S . stoloniferum . Мы также обнаружили маркер гена Rpi-vnt1.3 у большого числа гибридов, происхождение которых не связано с S . venturii . Это согласуется с недавним сообщением (30) о присутствии структурных гомологов указанного гена у S . microdontum ssp. gi-gantophyllum и S . phureja (NCBI GenBank accession numbers GU338312, GU338337). Выполненное нами клонирование SCAR маркеров R генов из межвидовых гибридов показало, что по нуклеотидным последовательностям эти маркеры на 98-100 % идентичны генам-прототипам. Там, где наблюдаются расхождения, их можно связать с видовым (аллельным) разнообразием R генов в пределах полиморфной секции Petota (33). По всей видимости, исследованные R гены распространены за пределами видов, в которых они были впервые описаны, то есть шире, чем ранее предполагалось. Это же подтверждали результаты скрининга дикорастущих видов Sol-anum , выполненного нами ранее (17, 24, 26, 33). Аналогичные результаты получены H . Rietman методом эффекторомики (32).

Самый важный вопрос при маркерном анализе дикорастущих и культурных форм картофеля заключается в том, указывает ли присутствие маркера на наличие функционального R гена. Даже полное сходство последовательности маркера с геном-прототипом не служит доказательством функциональной активности: структурные различия могут находиться за границами маркера, а для изменения функции продукта R гена — киназы достаточно одной нуклеотидной замены (34). Возможно, более определенный ответ даст использование специфичных Avr генов, различающих функциональные R гены и их неактивные гомологи (22).

Косвенным доказательством функциональности R генов, выявленных при помощи SCAR маркеров, служит взаимосвязь между присутствием этих маркеров и устойчивостью растений к фитофторозу. На рисунке показана зависимость полевой и лабораторной устойчивости 40 гибридов и сортов картофеля от числа маркеров R генов устойчивости в одном растении как характеристики пирамидирования генов устойчивости к фитофторозу. Для расчетов были взяты 40 генотипов — 10 сортов с низкой и высокой устойчивостью и все гибриды, кроме форм с предположительно неизвестными генами устойчивости (см. табл. 2, нижняя часть). Действительно, в этом случае устойчивость растений по результатам полевых и лабораторных тестов тесно связана с присутствием маркеров R генов: соответствующие коэффициенты параметрической корреля- ции Пирсона (0,74 и 0,67) и ранговой корреляции Спирмена (0,66 и 0,64) были значимы на уровне p < 0,01, а связь по критерию Вилкоксона — при p < 0,05. Эти данные свидетельствуют о несомненном вкладе расоспецифичных генов в устойчивость картофеля к фитофторозу (12).

Устойчивость возрастала с увеличением числа маркеров R генов, перенесенных методом гибридизации (рис.). Отсюда следует, что дальнейшие накапливающие скрещивания и отбор лучших сочетаний генов устойчивости под контролем маркеров R генов позволят объединить в одном растении больше генов устойчивости, чем современные технологии генной инженерии (1).

Число маркеров на одно растение

Связь лабораторной (А) и полевой (Б) устойчивости растений картофеля ( Solanum tuberosum L.) к фитофторозу с числом маркеров R генов: ■ — среднее, О — cpegHee±SEM, I— cpegHee±SD .

Особый интерес представляет небольшая группа межвидовых гибридов картофеля, которую мы оставили за пределами описанного выше статистического анализа. Они обладают высокой устойчивостью к фитофторозу, но не содержат ожидаемого большого числа маркеров R генов (см. табл. 2). Как оказалось, к этим формам относится и дигаплоид сорта Atzimba. Вероятно, такие формы несут расоспецифичные и расонеспецифичные гены устойчивости, не выявляемые с помощью примененных маркеров. В настоящее время нами ведется работа по созданию маркеров этих генов и их валидации для селекционного скрининга.

Таким образом, лучший способ противостоять появлению новых рас P . infestans — упреждающая селекция: создание селекционных доноров к фитофторозу на основе межвидовых гибридов с генами устойчивости, перенесенными из дикорастущих сородичей картофеля. Долговременная устойчивость этих гибридов определяется пирамидированием нескольких R генов (в совокупности они обеспечивают распознавание рас патогена с широким спектром специфичности и возможность оперативно реагировать даже на быстрые изменения в популяциях P . infestans ). Задача решается за счет поиска нового исходного материала среди культурных и дикорастущих форм Solanum L. секции Petota (особый интерес представляют дикорастущие виды, ранее не вовлекавшиеся в скрещивания) и создания пула межвидовых гибридов-доноров с несколькими генами устойчивости посредством интрогрессивной маркер-опосредованной селекции.

К настоящему времени в этом пуле, который поддерживается в виде клоновых коллекций в ВИР, ВНИИ картофельного хозяйства и ВНИИ фитопатологии, насчитывается более 60 межвидовых гибридов картофеля, охарактеризованных морфофизиологическими, фитопатологическими и молекулярными методами, которые уникальны по составу хозяйственно ценных генов и представляют собой готовый селекционный материал для создания сортов в сжатые сроки. Они получены традиционными методами гибридизации, что более трудоемко и затратно по времени, чем генетическая трансформация двумя-тремя генами устойчивости с широкой специфичностью. Однако по числу хозяйственно ценных генов в одном растении и способности противостоять большему числу рас P. infestans описанные клоны превосходят формы, полученные с помощью генно-инженерных технологий. Еще одно преимущество селекционных доноров на основе межвидовых гибридов — сохранение сложившегося в родительских формах генетического окружения (включая гены горизонтальной устойчивости) для интрогрессированных генов расоспецифичной устойчивости. Это стабилизирует создаваемые сорта и замедляет отбор более приспособленных форм патогена в посадках.

Итак, использование молекулярных маркеров генов устойчивости в интрогрессивной селекции означает переход к принципиально новому конструированию селекционных доноров. На примере гибридов картофеля, несущих генетический материал нескольких дикорастущих видов Solanum , нами показан значимый вклад R генов в устойчивость картофеля к фитофторозу, которая заметно возрастает при пирамидировании генов разной специфичности. Наши исследования клонов межвидовых гибридов с помощью маркеров шести R генов позволили выделить две группы генотипов: уникальные доноры для создания новых сортов и гибриды, которые несут редкие аллели генов устойчивости и поэтому перспективны прежде всего в качестве исходного материала для поиска и выделения не известных ранее R генов. Дальнейшее пирамидирование генов устойчивости посредством накапливающих скрещиваний с использованием детально охарактеризованных доноров и молекулярных маркеров позволит в ближайшем будущем создать сорта картофеля, способные сохранять продуктивность даже при значительных изменениях в популяциях Phytophthora infestans . Для этого, в свою очередь, требуется изучение специфичности генов устойчивости и конструирование надежных маркеров для массового селекционного скрининга.

Авторы благодарят Центр коллективного использования оборудования «Биотехнология» (Всероссийский НИИ сельскохозяйственной биотехнологии) за секвенирование фрагментов геномов Solanum.