Уровень оксидативного стресса в эндотелиальных клетках, культивируемых в присутствии митомицина С

Согласно статистике, патологии сердечно-сосудистой системы на настоящий момент занимают лидирующую позицию в структуре заболеваемости и смертности как во всем мире, так и в России, с тенденцией к росту в 2030 г. до 23 млн случаев. При этом причиной абсолютного большинства смертей среди всех патологий сердечно-сосудистого континуума является атеросклероз [1], представляющий собой мультифакторное воспалительное заболевание, в основе которого лежит развитие эндотелиальной дисфункции, факторами риска которой является гиперхолистеремия, артериальная гипертензия, сахарный диабет, курение и ряд других [2]; обсуждается также роль повреждения ДНК в атерогенезе [3].

В последнее десятилетие активно изучалась связь между воспалением, оксидативным стрессом, мутагенезом и атерогенезом [3]. Так, известно, что некоторые факторы риска развития атеросклероза (например, сахарный диабет и курение), а также ряд экзогенных токсических веществ способствуют образованию активных форм кислорода в сосудистом русле, участвующих в атерогене-зе [4]. Отмечается повышенный уровень ароматических ДНК-аддуктов, являющихся маркерами оксидативного стресса, в клетках атеросклеротических бляшек, таких как макрофаги, гладкомышечные и эндотелиальные клетки, по сравнению со здоровыми тканями [5]. В экспериментальных работах показано, что экспозиция культур первичных эндотелиальных клеток человека мутагеном митомицином С (ММС) приводит к выраженному воспалительному ответу и развитию эндотелиальной дисфункции [6]. Известно, что ММС способен вызвать генотоксический стресс за счет образования поперечных сшивок молекулы ДНК в результате реакции N-алкилирования, что приводит в конечном итоге к нарушению процессов транскрипции, трансляции и гибели клеток путем апоптоза [7]. Кроме этого, ММС способен вызвать и оксида-тивный стресс за счет циклического одноэлектронного восстановления молекулы ММС с последующим окислением молекулярным кислородом, в результате чего образуется супероксидный радикал – чрезвычайно активная частица, относящаяся к активным формам кислорода. Активные формы кислорода оказывают повреждающее действие на различные типы биологических молекул, таких как ДНК, липиды и белки, что приводит к инактивации ферментов, повреждению ДНК, дисфункции и гибели клеток [8]. Таким образом, понимание ведущего механизма действия ММС на эндотелиальные клетки, приводящего к развитию эндотелиальной дисфункции, является чрезвычайно актуальным для современной сосудистой биологии и внесет вклад в понимание фундаментальных аспектов атерогенеза.

Цель исследования: оценить уровень маркеров окси-дативного стресса в культурах первичных эндотелиальных клеток человека, экспонированных мутагеном алкилирующего механизма действия ММС.

Материал и методы

Материалом исследования послужили коммерческие культуры первичных эндотелиальных клеток коронарной (Human Coronary Artery Endothelial Cells, HCAEC) и внутренней грудной (Human Internal Thoracic Endothelial Cells, HITAEC) артерий (Cell Applications, США). Данные клеточные линии были выбраны в связи с их разной по-ражаемостью атеросклерозом: так, атеросклеротическое поражение коронарной артерии встречается наиболее часто, в том время как внутренняя грудная артерия практически не подвержена атеросклерозу [9]. Все работы с клеточными культурами проводили в асептических условиях. Клетки культивировали в условиях повышенной влажности, 5%-го содержания CO₂ и при температуре 37 ˚C в среде для роста клеток Human MesoEndo Cell Growth Medium (Cell Applications, США) до достижения 80% конфлюентности, после чего пересевали в 6-лу-ночные культуральные планшеты, содержащие по 2 мл среды для роста клеток в каждой лунке, и культивировали еще сутки. После окончания культивирования старую среду для роста клеток удаляли и приливали в каждую лунку 2 мл свежей среды, содержащей 500 нг/мл алкилирующего мутагена ММС (AppliChem, Испания) (экспериментальная группа) или 0,9% раствор NaCl (контрольная группа). Экспериментальные и контрольные планшеты культивировали в стандартных условиях в течение 6 ч, после этого проводили замену культуральной среды на чистую и культивировали клетки еще сутки, после чего выводили из эксперимента. Выбор концентрации ММС и времени культивирования в условиях мутагенной нагрузки был обусловлен имеющимися рекомендациями по моделированию мутагенеза in vitro и результатами собственных исследований [6].

Относительная длина теломерных (ОДТ) участков ДНК оценивалась методом количественной полимеразной цепной реакции (кПЦР) с детекцией продуктов амплификации в режиме реального времени с использованием SYBR Green праймеров, изготовленных компанией ЗАО «Евроген» (Москва, Россия). В качестве референса был использован ген HBG1 . Характеристика праймеров, использованных для оценки ОДТ, представлена в таблице 1.

Таблица 1. Характеристика праймеров, использованных для оценки относительной длины теломер

Table 1. Characteristics of primes used for relative telomere length assessment

Праймер Primer

Telo

HBG1

Последовательность Sequence

F:GGTTTTTGAGGGTGAGGGTGAGGGTGAGGGTGA GGGT

R:TCCCGACTATCCCTATCCCTATCCCTATCCCTATCC CTA

F:GCTTCTGACACAACTGTGTTCACTAGC R:CACCAACTTCATCCACGTTCACC

Примечание: ОДТ – относительная длина теломер, F – прямой праймер, R – обратный праймер.

Note: RLT – relative telomere length, F – forward primer, R – reverse primer.

Из экспериментальных и контрольных клеток HCAEC и HITAEC выделяли геномную ДНК по стандартному протоколу фенол-хлороформной экстракции и оценивали ее качество на спектрофотометре NanoDrop 2000 (Thermo Scientific, США). ПЦР проводили на амплификаторе ViiA 7 (Applied Biosystems, США) в 96-луночном планшете, включающем в себя изучаемые образцы, пять стандартов с двукратным разведением и отрицательный контроль, анализируемые в трех технических повторах. Для проведения амплификации на каждый образец готовили по 10 мкл реакционной смеси, содержащей 5 мкл мастер-микса PowerUp SYBR Green Master Mix (Applied Biosystems, США), по 500 нМ прямого и обратного праймеров (ЗАО «Евроген», Москва) и 5 мкл раствора геномной ДНК (либо деионизированной воды в случае с отрицательным контролем). Амплификацию проводили по следующей программе: 2 мин при 50 °C (1 цикл), 2 мин при 95 °C (1 цикл), 15 с при 95 °C и 60 с при 60 °C (40 циклов). ОДТ рассчитывалась по следующей формуле:

ОДТ = [2 Ct (Telo) /2 Ct (HBG1) ] –1 [10].

Для оценки экспрессии генов POT1 и TERT было проведено выделение общей РНК из эндотелиальных клеток при помощи коммерческого набора RNeasy Plus Universal Mini Kit (Qiagen, Германия) по протоколу производителя. Количество и чистота выделенной РНК определяли на спектрофотометре NanoDrop 2000 (Thermo Scientific, США), а ее качество – на флуориметре Qubit

4 (Invitrogen, США) путем оценки индекса RIQ (RNA Integrity and Quality) с использованием набора реагентов Qubit RNA IQ Assay Kit (Invitrogen, США). Далее на основе выделенной РНК с помощью реакции обратной транскрипции и набора High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit (Applied Biosystems, США) была синтезирована молекула комплиментарной ДНК (кДНК). Генная экспрессия оценивалась с помощью метода кПЦР с использованием SYBR Green праймеров, изготовленных компанией ЗАО «Евроген» (Москва, Россия), на амплификаторе ViiA 7 (Applied Biosystems, США). Нормирование результатов ПЦР проводилось с помощью трех референсных генов на ампли-фикаторе ViiA 7 (Applied Biosystems, США), таблица 2.

Таблица 2. Характеристика праймеров, использованных для оценки генной экспрессии

Table 2. Characteristics of primers used for gene expression assessment

Праймер Primer	Последовательность Sequence
POT1	F:GCAAAAGGAGTATTCTAACAAACAG R:TCACGCTTACACCAAAATCG
TERT	F:TTTCTGGAGCTGGTTGGGAA R:GAAGAGCCTGAGCAGCTCGA
HPRT1	F:TTGCTTTCCTTGGTCAGGCA R:TCGTGGGGTCCTTTTCACCA
GAPDH	F:AGCCACATCGCTCAGACAC R:GCCCAATACGACCAAATCC
B2M	F:TCCATCCGACATTGAAGTTG R:CGGCAGGCATACTCATCTT

Примечание: F – прямой праймер, R – обратный праймер.

Note: F – forward primer, R – reverse primer.

Методика приготовления реакционной смеси и программа амплификации были аналогичны описанным в разделе по оценке ОДТ. Уровень экспрессии генов POT1 и TERT рассчитывали по методу ΔC_t (Уровень экспрессии = 2^Ct [среднее геометрическое референсных генов] -Ct [ген интереса]) и выражали в виде условных единиц (у. е.). Оценку генной экспрессии проводили в строгом соответствии с существующими стандартами [11].

Статистический анализ результатов исследования выполняли в программе StatSoft STATISTICA 10. Для количественных показателей рассчитывали медиану ( m ) и межквартильный размах (IQR), сравнение двух независимых групп проводили с помощью U- критерия Манна – Уитни. Различия между группами считали статистически значимыми при значениях p < 0,05.

Результаты

В результате оценки уровня маркеров оксидативно-го стресса в клеточных культурах, таких как ROS, NO2–, NO3–, NO2–/NO3– и 8-OHdG, не обнаружено статистически значимого изменения изученных показателей в клетках HCAEC и HITAEC, экспонированных ММС, по сравнению с контрольной группой (рис. 1).

Одновременно с этим в экспонированных ММС клетках HCAEC и HITAEC было отмечено уменьшение ОДТ по сравнению с неэкспонированным контролем (10,97 против 27,03 в клетках HCAEC, p = 0,002 и 9,12 против 25,64 в клетках HITAEC, p = 0,001). Кроме того, в клетках HCAEC было обнаружено статистически значимое 1,75-кратное увеличение уровня экспрессии гена POT1 (Protection Of

Telomeres 1) на уровне p = 0,019, в то время как в клетках HITAEC данный ген экспрессировался на одинаковом уровне и в экспериментальной, и в контрольной группах (рис. 2). Ген TERT (Telomerase Reverse Transcriptase) в изученных клеточных культурах не экспрессировался.

Обсуждение

Вместе с тем токсическое действие ММС на биологические молекулы, в том числе и на ДНК, может проявляться и посредством активации оксидативного стресса, в результате чего происходит образование гидроксильного радикала (•OH), который вовлечен в большинство путей оксидативного повреждения молекулы ДНК [13]. Образование •OH зачастую сопровождается активацией NO-синтаз, стимулирующих образование оксида азота (•NO), который может взаимодействовать с анион-ради-калом с образованием достаточно мощного окислителя пероксинитрита (ONOO-), относящегося к реактивным формам азота и также участвующего в повреждении ДНК [14]. Для оценки свободнорадикального повреждения ДНК наиболее часто используется такой маркер, как 8-OHdG [15].

В результате проведенного нами исследования в эндотелиальных клетках различных артерий, in vitro экспонированных мутагеном алкилирующего механизма действия ММС, не выявлено повышения активных форм кислорода, реактивных форм азота и 8-OHdG по сравнению с неэкспонированным контролем. Вместе с тем существующие исследования на моделях лабораторных животных показывают, что пораженная атеросклерозом аорта характеризуется уменьшением уровня оксидатив-ных повреждений ДНК от интимы к адвентиции, при этом в интиме уровень 8-OHdG в 2,8 раза выше, чем в медии, что объясняется хронической экспозицией эндотелиального монослоя сосудов мутагенами окружающей среды, циркулирующими в кровотоке [5].

Несмотря на отсутствие повышения уровня свободных радикалов в экспонированных ММС клеточных культурах, в нашем эксперименте было обнаружено значительное снижение ОДТ эндотелиальных клеток из экспериментальной группы. Длина теломер поддерживается за счет фермента теломеразы, кодируемого геном TERT . Показано, что изменение длины теломер ассоциировано с воспалением и оксидативным стрессом [16].

Оксидативный стресс способствует разрушению теломерных участков хромосом в процессе клеточного деления in vitro и также стимулирует выработку провоспалительных цитокинов [17]. Интересно, что в нашем эксперименте в экспонированных ММС эндотелиальных клетках наблюдается снижение ОДТ с одновременным отсутствием выраженного оксидативного стресса (уровень активных форм кислорода, реактивных форм азота и 8-OHdG в экспериментальной и контрольной группах находился на одном и том же уровне). Вероятным объяснением этого может служить деградация теломерных участков ДНК в результате прямого действия ММС, а также воздействие на теломеры провоспалительных цитокинов, активно синтезирующихся в результате экспозиции клеточных культур ММС и участвующих в клеточном старении, при котором также отмечается уменьшение длины теломер [18]. Наблюдаемое в экспонированных ММС клетках HCAEC (более чувствительных к действию ММС в сравнении с клетками HITAEC) повышение экспрессии гена POT1, кодирующего белок, защищающий теломеры от повреждения за счет подавления ATR-сигнального пути и привлечения теломеразы к теломерам для их восстановления [19], вероятно, является компенсаторным механизмом на действие мутагена, играющим важную физиологическую роль, заключающуюся в поддержании стабильности хромосом эндотелиальных клеток, культивируемых в условиях генотоксической нагрузки. Необходимо отметить, что нам не удалось оценить экспрессию гена TERT в изученных группах, что, вероятно, связанно с чрезвычайно низким уровнем экспрессии теломеразы в зрелых клетках [20].

Следует отметить, что представленное исследование имеет ряд ограничений. В частности, результаты, полученные в ходе эксперимента in vitro , должны быть проверены в экспериментах на лабораторных животных для того, чтобы смоделировать изучаемые эффекты не только в клеточных культурах, но и в условиях живого организма. Использование in vivo моделей позволит смоделировать хроническую экспозицию клеток мутагеном.

Заключение

В результате проведения исследования установлено, что мутаген алкилирующего механизма действия ММС в эксперименте in vitro не вызывает выраженный оксидатив-ный стресс в культурах первичных эндотелиальных клеток человека. Формирование эндотелиальной дисфункции, ассоциированной с экспозицией клеток ММС, обусловлено, главным образом, генотоксическим стрессом, связанным с алкилированием ДНК эндотелиальных клеток.