Уровень сиаловых кислот и имидазольных соединений в слюне больных раком легкого различных гистологических типов

Рак легкого остается актуальной проблемой онкологии. Он является наиболее часто встречающейся злокачественной опухолью и основной причиной смерти от онкологических заболеваний [1, 2]. Активно изучается возможность применения известных и новых опухолевых маркеров в первичной и дифференциальной диагностике рака легкого. Ряд исследователей указывают на возможность использования для этих целей гликопротеинов [3], в том числе серогликоидов и сиаловых кислот [4], а также имидазольных соединений [5]. В подавляющем большинстве исследований, посвященных изучению данных параметров, в качестве материала используют сыворотку крови, тогда как, на наш взгляд, перспективным является применение для этих целей слюны человека [6]. Исследование слюны имеет преимущества по сравнению с анализом венозной или капиллярной крови, что обусловлено неинвазивностью сбора материала [7, 8]. При этом слюна адекватно отражает биохимической статус и физиологическое состояние человека, что позволяет использовать ее как в клинической лабораторной диагностике, так и в научных целях [9, 10].

Смешанная слюна представляет собой вязкую жидкость, большую часть органических соединений которой составляют гликопротеины, представленные в основном муцином. Гликопротеины – сложные белки, содержащие до 80 % углеводов (N-ацетилглюкозамин, N-ацетилгалактозамин, галактоза, фукоза, манноза и нейраминовая кислота). Присутствие сиаловых кислот, обычно N-ацетилнейраминовой, и/или сульфатных остатков придает отрицательный заряд молекуле гликопротеина. Существует обширная статистика, показывающая связь между нарушениями гликоли-зирования и развитием онкопатологии [11]. Общее содержание серогликоидов, как наиболее лабильной фракции гликопротеинов, отражает протекание воспалительных и некробиотических процессов, в том числе при злокачественных опухолях.

Имидазольные производные включают аминокислоту гистидин и ее метаболиты (гистамин, уро-каниловая кислота и др.). Процессы малигнизации вызывают значительные изменения катаболизма гистидина. В результате внутримолекулярного дезаминирования из гистидина под действием ферментов гистидазы и уроканиназы образуется уроканиновая кислота. Известно, что при злокачественных опухолях различной локализации происходит уменьшение синтеза ферментов вплоть до почти полного его подавления. В связи с этим синтез уроканиновой кислоты также подавляется. Однако уровень эндогенного гистамина возрастает как в плазме крови, так и в самой опухолевой ткани [12]. Получены свидетельства секреции опухолевыми клетками гистамина, а также фермента, метаболизирующего гистамин, – гистаминазы [13]. Предполагают, что повышение активности гистаминазы в опухоли способствует изменению метаболизма полиаминов и образованию активных форм кислорода, участвующих в канцерогенезе [14]. Гистамин участвует в процессах воспаления и репарации, увеличивая проницаемость сосудов, запуская цитокиновый каскад и активацию клеток иммунной системы, стимулируя ангиогенез. В онкогенезе он может стимулировать процессы пролиферации и ангиогенеза, увеличивая скорость роста опухоли [15]. Считается, что при онкологических процессах, в том числе при раке легкого, уровень гистамина является параметром для мониторинга заболевания [16].

Целью исследования являлось изучение уровня сиаловых кислот, суммарного содержания имидазольных соединений и серогликоидов в слюне больных раком легкого в зависимости от гистологического типа опухоли.

Материал и методы

В исследование включены 278 пациентов Клинического онкологического диспансера г. Омска мужского пола и 200 практически здоровых муж- таблица 1

Содержание гликопротеинов и имидазольных веществ в слюне в сравниваемых группах

Показатель	Контрольная группа (n=200)	Группа сравнения (n=60)	Основная группа (n=218)
	0,220	0,125	0,153
Сиаловые кислоты, ммоль/л	[0,146; 0,317]	[0,079; 0,225] р1 < 0,001	[0,092; 0,244] р1 < 0,001, р2=0,043
Имидазольные соединения, ммоль/л	0,270	0,357	0,326
	[0,172; 0,361]	[0,197; 0,554] р1=0,002	[0,212; 0,501] р1 < 0,001
	0,086	0,098	0,102
Серогликоиды, у.е.	[0,057; 0,122]	[0,056; 0,144]	[0,057; 0,160] р1=0,048

Примечание: p1 – различия статистически значимы по сравнению с показателями контрольной группы; p2 – различия статистически значимы по сравнению с показателями группы сравнения.

чин, выбранных в качестве контрольной группы. Основная группа включала 218 больных раком легкого различного гистотипа (аденокарцинома (АК) – 93, плоскоклеточный рак (ПРЛ) – 85, мелкоклеточный рак (МРЛ) – 22, смешанный рак – 10, карциноид – 8); группа сравнения – 60 больных с незлокачественной легочной патологией, из них 20 – с туберкулемой легких, 28 – с гамартомой, 12 – с саркоидозом легких. В основной группе средний возраст больных составил 58,5 ± 0,9 года, в группе сравнения – 56,0 ± 2,1 года, в контрольной группе – 49,4 ± 4,7 года.

Группы обследуемых были сформированы согласно правилам проведения клинических испытаний после получения информированного согласия. Критерии включения в исследование: возраст 30–70 лет, отсутствие специального лечения на момент проведения исследования, отсутствие признаков активной инфекции (включая гнойные процессы), проведение санации полости рта. У всех пациентов до начала лечения проводили забор слюны в объеме 1 мл, во всех образцах определяли концентрацию сиаловых кислот, имидазольных соединений и серогликоидов [17].

Статистический анализ выполнен при помощи программ Statistica 10.0 (StatSoft, США) и пакета R (версия 3.2.3) непараметрическим методом с использованием U-критерия Манна – Уитни. Описание выборки производили с помощью подсчета медианы (Ме) и интерквартильного размаха в виде 25-го и 75-го процентилей [LQ; UQ]. Различия считали статистически значимыми при p<0,05.

Результаты

На первоначальном этапе исследования было проведено определение нормального содержания сиаловых кислот, имидазольных соединений и серогликоидов в слюне (табл. 1). Показано, что в норме содержание сиаловых кислот выше, чем при патологиях легких, тогда как концентрация имидазольных веществ и серогликоидов существенно ниже. Снижение уровня сиаловых кислот в группы сравнения составило 43,2 %, в основной группе – 30,5 % (р1<0,001), причем различия между основной группой и группой сравнения также статистически значимы (р2=0,043). Концентрация имидазольных соединений выше как в группе сравнения (32,2 %), так и в основной группе (20,7 %) по сравнению с контролем. Динамика уровня серогликоидов менее выражена, однако наблюдается тенденция роста данного показателя в группе сравнения и основной группе – на 14,0 и 18,6 % соответственно.

Группа больных раком легкого неоднородна, поскольку объединяет несколько гистологических типов опухолей, из них большинство (~85 %) составляют аденокарцинома и плоскоклеточный рак. На следующем этапе исследования проведено определение содержания гликопротеинов и имидазольных веществ в слюне больных раком легкого различных гистологических типов (табл. 2). Cтатистически значимые отличия уровня сиаловых кислот по сравнению с контрольной группой отмечены для АК, ПРЛ и смешанного (АК + ПРЛ) рака легкого. Концентрация имидазольных соединений была значимо выше во всех исследуемых подгруппах, кроме пациентов с карциноидными новобразованиями. При данном гистотипе опухолей легкого у больных наблюдался повышенный уровень сиаловых кислот, близкое к нормальному содержание имидазольных соединений и повышенный уровень серогликоидов (табл. 2).

Дополнительно были рассчитаны коэффициенты корреляции по Спирмену между определяемыми параметрами для каждой из сравниваемых групп. Подтверждена слабая положительная корреляционная связь между содержанием сиаловых кислот и серогликоидов в слюне контрольной группы (r=0,1820, p<0,05). Данная связь усиливается в группе сравнения (r=0,4230). Пациенты с ПРЛ занимают промежуточное положение (r=0,2626), тогда как у больных с АК и МРЛ наблюдается усиление корреляционного взаимодействия (r=0,4969 и r=0,5609 соответственно). У пациентов с АК наблюдается также слабая отрицательная корреляция между содержанием имидазольных соединений и серогликоидов (r=-0,2677), однако при МРЛ это взаимодействие становится положительным (r=0,4906).

таблица 2

Содержание гликопротеинов и имидазольных веществ в слюне в зависимости от гистотипа рака легкого

Показатель	АК (1),	ПРЛ (2),	МРЛ (3),	АК+ПРЛ (4),	Карциноид (5),
	n=93	n=85	n=22	n=10	n=8
	0,134	0,171	0,201	0,131	0,336
Сиаловые кислоты,	[0,098; 0,226]	[0,087; 0,250]	[0,082; 0,366]	[0,104; 0,146]	[0,238; 0,372]
ммоль/л	р < 0,001	р < 0,001		р=0,010	р1–5=0,013, р2–5=0,017, р4–5=0,009
	0,357	0,303	0,372	0,368	0,296
Имидазольные соединения, ммоль/л	[0,220; 0,516] р < 0,001	[0,212; 0,516] р=0,023	[0,273; 0,615] р=0,002	[0,167; 0,584] р < 0,001	[0,106; 0,319]
	0,093	0,099	0,105	0,083	0,151
Серогликоиды, у.е.	[0,046; 0,152]	[0,063; 0,160]	[0,053; 0,181]	[0,046; 0,094]	[0,106; 0,184] р=0,045,
					р4–5=0,038

Примечание: p – различия статистически значимы по сравнению с показателями контрольной группы.

На следующем этапе была изучена динамика уровня гликопротеинов и имидазольных соединений в слюне в зависимости от распространенности опухоли. Поскольку пациентов с диагнозом МРЛ было недостаточно для разбиения по стадиям, то в дальнейшем рассматриваются только группы пациентов с АК и ПРЛ (табл. 3). Отмечена тенденция нелинейного изменения уровня сиаловых кислот, их содержание растет по мере увеличения распространенности процесса, при этом наблюдаются локальные максимумы и минимумы, соответствующие стадиям T2N0–3M0 и T4N0–3M0 соответственно. Для уровня имидазольных соединений видна тенденция монотонного увеличения вплоть до стадии T4N0–3M0, при наличии отдаленных метастазов данный показатель снижается как при АК, так и при ПРЛ. Уровень серогликоидов нелинейно возрастает, существенные отличия наблюдаются при наличии метастазов в легких, при этом концентрация серогликоидов в слюне пациентов с ПРЛ в 1,7 раза выше, чем с АК.

Одним из прогностически важных факторов, определяющих показатели выживаемости, является выраженность лимфогенного метастазирования. Показано, что характер изменения отдельных параметров существенно отличается для АК и ПРЛ (табл. 4). Уровень сиаловых кислот максимален у больных АК с N1 и при большем поражении лимфоузлов снижается, тогда как при ПРЛ с аналогичной лимфогенной распространенностью этот показатель кислот минимален и в дальнейшем повышается до первоначальных значений. Как для АК, так и для ПРЛ характерно нарастание уровня имидазольных соединений, и снижение концентрации серогликоидов наблюдается по мере перехода от N0 к N3.

Обсуждение

Полученные результаты показывают, что на фоне как доброкачественных изменений, так и злокачественных новообразований в легких происходит увеличение суммарного содержания имидазольных соединений. Причем этот процесс одинаково выражен для большинства гистологических форм рака легкого, за исключением карциноидных опухолей. В зависимости от распространенности процесса как при АК, так и при ПРЛ наблюдается равномерный рост уровня имидазольных веществ до стадии T4N0–3M0. Следует учесть, что на ранних стадиях заболевания для этих гистотипов рака легкого характерен более низкий уровень имидазольных веществ, чем в норме: для АК – на 27,0 %, для ПРЛ – на 15,6 %. При АК стадии T2N0–3M0 и при ПРЛ стадии T2–3N0–3M0 уровень имидазольных соединений близок к нормальному, для стадий T3–4N0–3M0–1 характерен максимум этого покаателя, однако на фоне метастатического поражения легких содержание производных гистидина снижается: при АК – на 25,1 %, при ПРЛ – на 29,6 %. По-видимому, на начальных стадиях заболевания включены резервы имидазольных соединений, а активный рост опухоли способствует увеличению секреции гистамина, однако на фоне некроза опухолевой ткани и возникновения новых очагов в легких секреция гистамина несколько снижается [18]. При отсутствии регионарного метастазирования содержание имидазольных соединений соответствует норме, однако при метастатическом поражении лимфоузлов их уровень существенно повышается, причем при N3 уровень производных гистидина существенно возрастает по сравнению с N0: для АК – на 91,9 %, для ПРЛ – на 81,3 %.

Интересным является сопоставление описанных выше изменений с динамикой содержания гликопротеинов, в частности сиаловых кислот. В норме концентрация сиаловых кислот максимальна, при патологии легких наблюдается ее уменьшение. Причем, как и в случае имидазольных производных, максимальное отклонение от нормы таблица 3

Содержание гликопротеинов и имидазольных веществ у больных раком легкого в зависимости от гистотипа и стадии опухоли

	Стадия по классификации TNM
Аденокарцинома T1N0–3M0 (1), n=7	T2N0–3M0 (2),    T3N0–3M0 (3) n=9    T4N0–3M0 (4), n=44                      ,            n=12	T1–4N0–3M1 (5), n=21

Сиаловые кислоты,	0,128	0,140	0,122	0,281	0,101
ммоль/л	[0,107; 0,189]	[0,095; 0,226]	[0,061; 0,153]	[0,095; 0,409]	[0,061; 0,183]
	0,197	0,285	0,395	0,486	0,364
Имидазольные сое-	[0,175; 0,744]	[0,167; 0,436]	[0,220; 0,554]	[0,300; 0,535]	[0,266; 0,516]
динения, ммоль/л		р2–4=0,010		р2–4=0,010
Серогликоиды, у.е.	0,139 [0,065; 0,166]	0,103 [0,071; 0,163]	0,115 [0,042; 0,149]	0,097 [0,054; 0,127]	0,061 [0,028; 0,137]
Плоскоклеточный		Стадия по классификации TNM
рак легкого	T1N0–3M0 (1), n=4	T2N0–3M0 (2), n=28	T3N0–3M0 (3), n=22	T4N0–3M0 (4), n=11	T1–4N0–3M1 (5), n=20
	0,098	0,207	0,130	0,235	0,165
Сиаловые кислоты,	[0,070; 0,244]	[0,153; 0,305]	[0,079; 0,232]	[0,061; 0,262]	[0,098; 0232]
ммоль/л		р2–3=0,041	р2–3=0,041
	0,228	0,269	0,285	0,463	0,326
Имидазольные сое-	[0,212; 0,228]	[0,159; 0,448]	[0,212; 0,448]	[0,311; 0,596]	[0,152; 0,486]
динения, ммоль/л		р2–4=0,049		р2–4=0,049
Серогликоиды, у.е.	0,102 [0,093; 0,151]	0,112 [0,065; 0,228]	0,103 [0,053; 0,119]	0,125 [0,076; 0,174]	0,104 [0,051; 0,159]

Примечание: p – различия статистически значимые.

характерно для группы сравнения. Можно предположить, что данные биохимические параметры характеризуют наличие/отсутствие патологии легких в целом. Тем не менее различия по уровню сиаловых кислот между основной группой (рак легкого) и группой сравнения (неопухолевая патология) статистически значимы. При сопоставлении различных гистотипов рака легкого можно отметить значительно более низкий уровень сиаловых кислот при АК и смешанном раке, средний – при ПРЛ, тогда как при МРЛ содержание сиаловых кислот не отличается от нормального, при карциноидных опухолях – значимо выше (табл. 2). Сходное повышение уровня сиаловых кислот при МРЛ и карциноиде объясняется тем, что они относятся к образованиям одного гистогенеза – нейроэндокринным опухолям. Однако карциноиды легких являются достаточно редкими новообразованиями, поэтому значительно более высокий уровень сиаловых кислот может быть связан с недостаточно представительной выборкой (n=8).

В литературе имеются противоречивые данные, согласно которым содержание сиаловых кислот в крови больных раком легкого значимо превышает аналогичные показатели у здоровых доноров, а также у пациентов с неопухолевыми заболеваниями легких [19]. Однако значимых отличий уровня сиаловых кислот в крови и жидкости бронхиального лаважа у пациентов с раком легкого и неопухоле- выми заболеваниями не найдено [20]. Увеличение уровня сиаловых кислот в крови при раке легкого положительно коррелирует с метастазированием данной опухоли [21]. Известно, что содержание сиаловых кислот связано с уровнем острофазовых белков, в частности α-1 кислого гликопротеина, концентрация которого может возрастать при любом патологическом процессе [22]. Большая часть молекулы α-1 кислого гликопротеина представлена углеводным компонентом, характеризующимся наличием концевых N-ацетилнейраминовых остатков – сиаловых кислот. Повышенная сиа-лированность углеводных цепей способствует маскировке гликановых антигенных детерминант при онкологических процессах [23]. Уменьшение количества концевых N-ацетилнейраминовых остатков обусловливает появление свободных сиаловых кислот в крови. В норме, как правило, в свободном виде сиаловые кислоты встречаются в незначительном количестве [24]. Общий уровень сиаловых кислот является суммой двух фракций: связанных с гликоконъюгатами и свободно циркулирующих в кровотоке, его определение дает полную информацию об активности процессов сиалирования и десиалирования белков в организме. Показана отрицательная корреляционная связь между концентрацией сиаловых кислот и α-1 кислого гликопротеина при миелопролиферативных заболеваниях, которая отсутствует в норме таблица 4

Содержание гликопротеинов и имидазольных веществ в слюне у больных раком легкого в зависимости от лимфогенной распространенности опухоли

Аденокарцинома	Критерий N
	N0 (n=31)	N1 (n=28)	N2 (n=20)	N3 (n=14)
Сиаловые кислоты,	0,156	0,183	0,122	0,101
ммоль/л	[0,104; 0,238]	[0,095; 0,220]	[0,098; 0,201]	[0,037; 0,183]
	0,273	0,406	0,368	0,524
Имидазольные соеди-	[0,175; 0,463]	[0,212; 0,455]	[0,266; 0,637]	[0,372; 0,683]
нения, ммоль/л		р=0,003	р=0,042	р < 0,001
Серогликоиды, у.е.	0,104	0,086	0,075	0,041
	[0,086; 0,166]	[0,058; 0,124]	[0,040; 0,139]	[0,023; 0,203]
Плоскоклеточный рак легкого	N0 (n=30)	Критерий N N1 (n=14)             N2 (n=31)		N3 (n=10)
Сиаловые кислоты,	0,168	0,101	0,189	0,171
ммоль/л	[0,088; 0,305]	[0,085; 0,232]	[0,089; 0,262]	[0,107; 0,232]
Имидазольные соеди-	0,247	0,322	0,349	0,448
нения, ммоль/л	[0,175; 0,448]	[0,220; 0,524]	[0,250; 0,516]	[0,197; 0,827]
	0,121	0,101	0,065	0,045
Серогликоиды, у.е.	[0,081; 0,177]	[0,066; 0,149]	[0,041; 0,121]	[0,040; 0,066]
			р=0,044	р=0,012

Примечание: p – различия статистически значимы по сравнению с показателями у больных с N0 для соответствующего гистологического типа рака легкого.

• [25]. Известно, что нарушенное гликолизирование раковых клеток, в частности повышенный уровень сиалирования клеточных мембран, связано с процессом малигнизации, с инвазивным и метастатическим потенциалом [26]. Установлено, что десиалирование опухолевых клеток снижает их потенциал роста, делая их более уязвимыми для клеток иммунной системы.

Однако в отличие от крови, где наблюдается увеличение уровня сиаловых кислот на фоне опухоли, в слюне наблюдаются противоположные изменения – уменьшение содержания сиаловых кислот. По-видимому, это обусловлено спецификой данной биологической жидкости, в частности высоким содержанием муцина. Вероятно, в норме преобладают сиаломуцины слюны, тогда как при патологии легких секретируются нейтральные и кислые муцины [11], при этом опухолевые клетки интенсивно связывают сиаловые кислоты [27], в результате уровень свободных сиаловых кислот в слюне в норме существенно выше, чем при раке легкого.

Как в случае АК, так и ПРЛ наблюдается сходная динамика концентрации сиаловых кислот: максимальное падение относительно нормы на I стадии, затем активный рост на стадии T2N0–3M0, наиболее ярко выраженный для ПРЛ. Вероятно, на начальной стадии развития опухоли опухолевые клетки интенсивно связывают сиаловые кислоты. Уровень свободных сиаловых кислот в слюне падает, однако на фоне снижения защитных механизмов уровень сиаловых кислот возрастает и стабилизируется вплоть до стадии T3N0–3M0. При дальнейшем прогрессировании заболевания наблюдается резкое увеличение уровня свободных сиаловых кислот в слюне, которое несколько уменьшается в случае появления метастатического поражения легких. Интересная ситуация складывается при рассмотрении процесса регионарного метастазирования. Существует локальный максимум концентрации сиаловых кислот, соответствующий поражению перибронхиальных и/или лимфатических узлов корня лёгкого (N1), для АК, при аналогичной лимфогенной распространенности у больных с ПРЛ уровень сиаловых кислот минимален.

Доказано, что гистологический тип во многом определяет скорость роста опухоли и процессы метастазирования [28]. При этом учитываются как особенности метаболизма клеток опухолевой ткани, так и реактивность иммунной системы [29]. Установлено, что у больных ПРЛ и АК наблюдается сходное снижение концентрации Т-лимфоцитов и Т-хелперов при повышении содержания В-лимфоцитов [30]. Однако содержание натуральных киллерных клеток в периферической крови повышается только у больных ПРЛ, что позволяет предположить более выраженную интенсивность иммунных процессов в лимфоузлах. Таким образом, для АК характерен более низкий уровень сиаловых кислот как в среднем, так в динамике заболевания, что может быть связано с менее выраженными процессами десиалирования клеточных мембран, более высокой скоростью роста и метастатическим потенциалом, тогда как для ПРЛ уровень сиаловых кислот выше, что может свидетельствовать о меньшей скорости роста и более низком метастатическом потенциале. Снижение концентрации сиаловых кислот на фоне ПРЛ при регионарном метастазировании может являться результатом иммунного ответа, тогда как для АК подобного эффекта не наблюдается. При отдаленном метастазировании для АК сохраняются меньшее содержание свободных сиаловых кислот и более высокий уровень имидазольных производных. Для ПРЛ при отдаленном метастазировании уровень сиаловых кислот выше, а имидазольных веществ ниже, чем для АК.

Уровень серогликоидов у пациентов основной группы значимо выше, чем в группах контроля и сравнения. При этом основной вклад вносят нейроэндокринные опухоли (МРЛ, карциноид), при которых уровень серогликоидов максимален, что связано с продукцией этими новообразованиями биогенных аминов и активацией симпатико-адреналовой системы [31]. В динамике уровень серогликоидов снижается для АК и остается практически постоянным для ПРЛ. При сравнении с динамикой концентрации имидазольных