Уровни гормонов, микроРНК и цитокинов в лимфе в норме и при раке молочной железы в эксперименте

В патогенез рака молочной железы (РМЖ) вовлечены половые гормоны и гормоны щитовидной железы [1–4]. На основании уровней гормонов в сыворотке крови больных РМЖ прогнозируется эффективность терапии и риск метастазирования [1, 4]. В патогенезе опухолей, в том числе и РМЖ, принимают активное участие микроРНК [5]. Кроме этого, существенная роль при РМЖ отводится цитокинам, которые могут как активировать, так и ингибировать пролиферацию и метастазирование опухолевых клеток [6, 7]. Лимфа, разновидность соединительной ткани, которая составляет внутреннюю окружающую среду для клеток организма, в том числе и для молочных желез, собирает продукты жизнедеятельности клеток из межклеточного пространства, поэтому может служить для оценки функции клеток органов, например молочных желез.

Целью исследования стала оценка уровней гормонов, цитокинов и микроРНК, вовлеченных в патогенез РМЖ, в лимфе грудного протока при экспериментальной модели РМЖ.

Материал и методы

Эксперименты на лабораторных животных проведены в соответствии с принципами Хельсинкской декларации BMA (2000). Эксперименты выполнены на 118 неполовозрелых крысах-самках линии Wistar. Животные содержались на стандартной лабораторной диете и имели свободный доступ к воде. У 109 крыс РМЖ индуцировали N-метил-N-нитрозомочевиной (30 мг/кг, Sigma-Aldrich, США), 9 крыс составили группу контроля. Через 6 мес у 39 крыс оперативно удалили опухоль молочной железы, и далее 9 животных получили химиотерапию (ХТ), 30 животных не получали ХТ и составили

группу контроля оперативного способа лечения РМЖ. Кроме того, была группа животных, получавшая ХТ (n=30) по схеме: 5-фторурацил (Ebewe, Австрия в дозе 15 мг/кг внутрибрюшинно на 1-й и 8-й день курса терапии), метотрексат (Ebewe, Австрия, в дозе 2,5 мг/кг внутрибрюшинно на 1-й и 8-й день курса терапии) и циклофосфан (ОАО «Биохимия», Саранск, в дозе 3 мг/кг внутрибрюшинно ежедневно однократно 14 дней), и группа животных, которым не проводилось никакого лечения (n=30). Животных из эксперимента выводили через 6,5 мес под наркозом (40 мг/кг нембу-тана внутрибрюшинно; Sigma-Aldrich, США), что обусловливалось необходимостью прижизненного сбора лимфы. Уровни гормонов в лимфе определяли иммуноферментным анализом с использованием коммерческих наборов: «ГонадотропинИФА-ЛГ», «ГонадотропинИФА – ФСГ», «ИФА-Пролактин-01», «ТириодИФА – ТГ» (ООО «Компания Ал-кор Био», Санкт-Петербург, Россия) и «Estradiol ELISA» (DRG Diagnostics, Германия). Уровни цитокинов в лимфе изучали с помощью тест-системы Bio-Plex Pro Rat Cytokines 24-Plex Assay (Bio-Rad, США). Выделение суммарной РНК из лимфы проводили с использованием набора Qiagen (Rneasy® Lipid Tissue Mini kit (50), Германия). Обратную транскрипцию проводили для получения кДНК по матрице микроРНК, выделенной из образцов тканей с использованием набора реагентов ЗАО «Вектор-Бест». Для определения уровня экспрессии микроРНК miR-21, -221, -222, -429 в лимфе проводили ОТ-ПЦР в реальном времени с использованием реагентов ЗАО «Вектор-Бест» на амплификаторе CFХ96 (Bio-Rad Laboratories, США). Статистическую обработку данных проводили с использованием программы Statistica 6.0, меры центральной тенденции и рассеяния описаны медианой (Ме), нижним (Lq) и верхним (Hq) квар- тилями; достоверность различия рассчитывалась по U-критерию Манна – Уитни и принималась при значениях p<0,05.

Результаты и обсуждение

Анализ уровней гормонов в лимфе грудного протока у крыс в норме и при РМЖ (табл. 1) выявил статистически значимое снижение уровней пролактина, тиреоглобулина, ФСГ и эстрадиола на фоне ХТ (p<0,05). В группе крыс с РМЖ без лечения отмечено статистически значимое увеличение уровней пролактина, тиреоглобулина, ФСГ по сравнению с другими опытными группами (p<0,05).

В лимфе грудного протока опытных групп (табл. 2) отмечено статистически значимое увеличение уровней экспрессии микроРНК-21 по сравнению с контролем (p<0,05). Также при РМЖ в лимфе статистически значимо выше уровни экспрессии микроРНК-221 и микроРНК-222 по сравнению с контролем (p<0,05). Необходимо отметить тот факт, что при РМЖ без лечения и при сочетании оперативного вмешательства с курсом ХТ в лимфе грудного протока статистически значимо снижен уровень экспрессии микроРНК-429 по сравнению с контролем (p<0,05). Также показано, что с учетом вида проводимого лечения уровни экспрессии микроРНК-21, микроРНК-221 и микроРНК-222 чаще снижаются после оперативного вмешательства или же на фоне курса ХТ, по сравнению с другими опытными группами, а уровни экспрессии микроРНК-429 возрастают (p<0,05).

В лимфе грудного протока при РМЖ отмечено статистически значимое увеличение уровней IL-1α, IL-1β, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-10, IL-13, IL-17α, IL-18, IFNγ, MIP-1α, MIP-3α и RANTES, по сравнению с другими опытными группами, а также уровней эритропоэтина, за исключением группы

Таблица 1

Уровни гормонов в лимфе в норме и при раке молочной железы

Группы животных	Пролактин	Тиреоглобулин	ФСГ	ЛГ	Эстрадиол2
1. Контроль	544,134,5	6,252,5	19,593,4,5	5,73	526,822,3,5
	510,21–578,04	6,2–6,3	17,82–21,35	4,59–6,81	518,44–535,19
2. РМЖ	545,94 3,4	6,493,5	20,2 3,4,5	4,663	501,563
	541,51–600,24	6,38–7,82	18,67–35,62	4,59–6,05	492,07–516,95
3. РМЖ – операция	549,514	6,3	17,824	4,044,5	478,025
	530,76–549,51	6,08–6,3	17,51–17,82	3,16–4,04	478,02–487,24
4. РМЖ – операция + ХТ	492,29	6,955	16,34	5,7	444,59
	492,29–542,37	6,16–6,95	15,41–16,34	5,7–6,52	444,59–572,19
5. РМЖ – ХТ	514,68	6,06	13,92	5,67	490,55
	504,84–545,04	5,49–6,69	10,01–19,32	5,28–6,53	481,54–504,04

Примечание: 1,2,3,4,5 – группы животных; статистическая значимость различия между группами по U–критерию Манна – Уитни, p<0,05.

Таблица 2

Уровни микроРНК в лимфе в норме и при раке молочной железы

Группы животных	МикроРНК
	21	221	222	429
	3,1 2,3,4,5	0,55 2,3,5	0,78 2,3,4,5	1,712,5
1. Контроль	0,02–5,25	0,45–3,16	0,53–1,87	0,06–36,27
	27,253,5	0,813	1,433,4,5	1,023,5
2. РМЖ	22,82–54,71	0,09–2,71	1,27–2,41	0,53–2,07
	17,974,5	0,074,5	0,54,5	6,215
3. РМЖ – операция	17,56–20,25	0,07–0,07	0,34–0,56	5,68–6,73
	35,0	0,41	0,06	1,0
4. РМЖ – операция + ХТ	1,27–182,42	0,25–0,59	0,01–0,21	0,04–52,95
	16,38	0,14	0,25	13,24
5. РМЖ – ХТ
	10,91–16,93	0,14–0,15	0,22–0,29	9,89–14,84

Примечание: 1,2,3,4,5 – группы животных; статистическая значимость различия между группами по U–критерию Манна – Уитни, p<0,05.

животных, подвергшихся операции (p<0,05). Необходимо отметить, что уровни в лимфе грудного протока G-CSF и GM-CSF были ниже порога чувствительности набора (табл. 3).

Анализ сопряженностей уровней экспрессии микроРНК с уровнями гормонов и цитокинов в лимфе грудного протока в контрольной группе выявил наличие обратной и сильной взаимосвязи уровней IL-1β с уровнями экспрессии микроРНК21 и микроРНК-429 (r=-0,9; p=0,037), прямой и сильной взаимосвязи уровней IL-12 с уровнями экспрессии микроРНК-21 и микроРНК-429 (r=0,9; p=0,037), что может свидетельствовать о вовлеченности данных цитокинов в противоопухолевый иммунитет. В группе животных с РМЖ показана обратная и сильная сопряженность уровней экспрессии микроРНК-221 с уровнями IL-1α и IL-2 (r=-0,95; p=0,014 и r=-0,9; p=0,037 соответственно). Кроме этого, между уровнями экспрессии микроРНК-222 и уровнями IL-6, IL-10, IL-13 и M-CSF в лимфе грудного протока также имеется взаимосвязь (r=-0,9; p=0,037; r=0,9; p=0,037; r=-0,9; p=0,037 и r=-0,9; p=0,037 соответственно), что указывает на вовлеченность исследуемых параметров в процесс онкогенеза при РМЖ. После операции у животных определены сопряженности уровней экспрессии микроРНК-222 с уровнями VEGF в лимфе грудного протока (r=-0,97; p=0,005), что косвенно может свидетельствовать о наличии метастазов в организме животных, так как именно VEGF способствует неоангиогенезу в области опухоли и тем самым способствует метастазированию опухолевых клеток. В группе животных, которые после удаления опухоли получили курс ХТ, выявлены взаимосвязи уровней экспрессии микроРНК-221 с уровнями IL-1α, IL-2 и IL-12 (r=-0,94; p=0,014; r=-0,94; p=0,014 и r=0,9; p=0,037 соответственно), а также между уровнями экспрессии микроРНК-222 с уровнями IL-1α и IL-2 (r=-0,94; p=0,014), что также указывает на вовлеченность в онкогенез провоспалительных цитокинов при РМЖ. В группе животных с РМЖ, получивших только курс ХТ, установлены взаимозависимости уровней экспрессии микроРНК221 с уровнями в лимфе грудного протока VEGF (r=-0,97; p=0,005), а также между уровнями экспрессии микроРНК-429 и уровнями IL-13 и TNF-α (r=0,97; p=0,005), что отражает сохранность риска метастазирования, так как высокие уровни VEGF указывают на сохранность процесса неоангиогенеза, а высокие уровни IL-13 и TNF-α, с одной стороны, – на переключение организма носителя опухоли на синтез антител, которые могут маскировать антигенные структуры клеток опухоли, а с другой стороны, TNF-α способствует слущиванию клеток опухоли от основного очага роста опухоли и тем самым метастазированию.

Кроме этого, между уровнями цитокинов и уровнями гормонов в лимфе грудного протока в некоторых опытных группах также были выявлены взаимосвязи. Так, в группе животных с РМЖ уровни IL-1β сопряжены с уровнями тиреоглобулина и эстрадиола (r=-0,9; p=0,037 и r=0,9; p=0,037 соответственно), а уровни IL-7 – с уровнями пролактина и ФСГ (r=0,9; p=0,037), уровни IL-12 – с уровнями тиреоглобулина и эстрадиола (r=0,9; p=0,037 и r=–0,9; p=0,037 соответственно), уровни IL-17α – с уровнями пролактина и ЛГ (r=0,9; p=0,037), а уровни MIP-3α и RANTES – с уровнями пролактина (r=0,9; p=0,037), что отражает сложные молекулярные механизмы при онкогенезе. Кроме этого, только в группе животных, получивших курс ХТ, были показаны сопряженности уровней цитокинов с уровнями гормонов в лимфе грудного протока, а именно: IL-1α – с тиреоглобулином (r=0,95; p=0,014), IL-1β – с эстрадиолом (r==05,9; p=0,014), IL-5 и IL-7 – с эстрадиолом (r=0,95; p=0,014), MIP-1α и MIP-3α – с тиреоглобулином (r=0,95; p=0,014 и r=-0,95; p=0,014), MCP-1 с эстрадиолом (r=0,95; p=0,014), что отражает многоуровневый механизм канцерогенеза при РМЖ.

Снижение уровней в лимфе грудного протока гормонов, вовлеченных в патогенез при РМЖ, за исключением ЛГ, на фоне ХТ, может быть прояв-

Уровни цитокинов в лимфе в норме и при раке молочной железы Таблица 3 Параметры 1. Контроль 2. РМЖ 3. РМЖ -операция 4. РМЖ –операция + ХТ 5. РМЖ - ХТ IL-1α 48,82 75,383,4,5 20,34 43,36 29,19 16,65-70,9 46,65-75,38 13,25-20,3 27,34-43,36 23,6-37,56 IL-1β 42,752,4 402,24 3,4,5 41,434 48,61 53,05 35,71-43,07 294,33-466,59 26,38-45,17 46,88-49,71 40,61-70,01 IL-2 82,342, 401,41 3,5 73,3 5 226,255 106,7 82,34-136,87 226,17-402,64 46,76-85,3 146,76-366,0 104,2-147,65 IL-4 39,55 67,2 3,5 18,2 42,225 31,4 37,82-43,1 66,52-82,3 16,72-26,8 40,22-51,1 18,4-32,8 IL-5 137,825 128,32 5 93,93 5 83,11 5 33,17 118,85-170,23 107,69-205,2 79,72-128,32 76,15-161,45 28,32-34,23 IL-6 310,472,3 1400,43 4,5 843,1 5 392,4 337,9 200,34-330,47 667,7-1777,8 487,67-850,1 371,5-626,5 246,4-442,66 IL-7 128,22 435,32 3,4,5 110,16 4 126,25 5 59,06 101,3-228,2 420,98-442,05 58,8-116,8 126,25-266,1 11,5-61,95 IL-10 1465,992,3,4,5 499,68 4,5 411,4 4,5 129,06 101,6 1465,99-2207,07 364,48-522,78 402,94-727,06 119,41-178,6 96,21-102,09 IL-12 75,932,4 131,7 3,5 80,0 4 126,0 5 72,6 40,0-80,0 90,0-189,7 70,0-80,0 121,0-132,0 69,5-80,7 IL-13 12,722 112,06 3,4,5 18,51 88,0 15,32 10,0-26,54 59,53-610,13 16,61-19,88 47,0-98,0 14,1-21,64 IL-17α 49,792,3 243,34,5 137,54,5 71,4 71,2 33,14-69,9 143,7-341,4 102,1-142,9 46,28-90,3 62,7-73,8 IL-18 4740,973,4,5 2468,71 3 1130,09 1851,24 1022,47 4590,89-5276,72 2268,96-3345,73 1071,47-1151,34 1090,38-1861,4 290,21-2016,91 Epo 848,04 305,964 566,48 4,5 84,33 227,43 665,28-1167,65 50,68-594,19 554,59-626,8 64,2-85,1 66,27-317,07 GRO/KC 24,62,3,4 11,92 11,2 10,03 24,63 23,4-33,26 11,09-17,08 10,72-21,83 3,02-11,0 10,56-87,35 IFNγ 54,22,3,5 120,7 4,5 84,24,5 77,2 20,4 53,88-66,9 80,9-140,6 24,1-91,2 33,83-88,3 19,2-42,1 M-CSF 149,9 153,75 117,52 59,575 100,96 148,57-186,79 86,97-157,08 72,05-162,93 57,7-228,33 54,66-114,52 MIP-1α 1594,382 3528,23 3,4,5 1200,3 1737,42 700,7 1555,89-1614,86 3142,96-3549,64 754,91-2282,15 700,1-2119,04 194,93-1318,38 MIP-3α 120,12 307,5 3,4,5 72,1 71,4 55,6 60,7-121,6 250,1-333,33 38,13-92,13 61,5-142,6 54,28-78,5 RANTES 276,522,3,4 601,54 3,4 194,99 221,46 467,3 276,52-513,58 536,88-650,1 191,6-207,2 157,51-231,6 367,48-520,1 TNF-α 22,352,5 87,01 61,74 50,4 44,3 20,65-24,1 80,08-90,42 40,3-83,28 38,9-127,9 31,4-46,89 VEGF 106,03,5 60,75 67,4 58,65 33,08 76,4-133,02 18,56-67,06 41,09-68,78 54,8-66.7 32,6-43,47 MCP-1 624,142 777,9 846,97 767,79 552,83 477,82-747,32 767,79-935,57 579,11-1558,71 381,92-846,97 531,53-612,59 лением токсического эффекта медикаментозных с аналогичными исследованиями других авторов, препаратов не только на клетки опухоли, но и на показавших возрастание уровней экспрессии другие клетки организма, в том числе и на клетки микроРНК-21 в клетках опухоли молочной железы, эндокринных желез. Известно, что после курсов индуцированной N-метил-N-нитрозомочевиной ХТ у женщин с РМЖ снижены уровни эстрадиолов [9]. Повышенные уровни цитокинов в лимфе груд-в сыворотке крови [5], а на фоне оперативных вме- ного протока в опытных группах животных могут шательств меняются уровни гормонов [8]. Выяв- быть результатом продукции и секреции их не ленные изменения уровней экспрессии микроРНК только лимфоцитами, но и опухолевыми клетками при экспериментальной модели РМЖ согласуются молочной железы. Выявленные сопряженности уровней экспрессии микроРНК с цитокинами, а уровней цитокинов с уровнями гормонов свидетельствуют о вовлеченности данных молекул в канцерогенез при РМЖ и взаимовлиянии друг на друга, что косвенно указывает на многоуровневые патогенетические механизмы канцерогенеза и противоопухолевого иммунитета при РМЖ.