Условия и сроки хранения лиофилизированных поли- и моноклональных антитоксических пероксидазных конъюгатов

Perm University. Biology. Iss. 4 (2022): рр. 300-308. (In Russ.).

Холера, острая диарейная болезнь, вызываемая токсигенными штаммами Vibrio cholerae , продолжает оставаться приоритетной проблемой мирового здравоохранения. В настоящее время существует более 200 различных серогрупп холерных вибрионов, однако только токсигенные штаммы О1 и О139 серо-групп способны вызывать эпидемии холеры [Safa, Nair, Kong, 2010].

На основании биологических свойств представителей О1 серогруппы делят на биотипы – классический и El Tor, которые различаются по типу продуцируемого токсина, а также по нуклеотидной последовательности генов ctxB, кодирующих его биосинтез, и были обозначены у классических вибрионов как ctxAB1, у вибрионов El Tor – ctxAB3 [Kim et al., 2014].

В результате эволюционных преобразований клинических изолятов V. cholerae El Tor по всему миру появились геноварианты, которые содержат в опероне ctxAB, кодирующем биосинтез токсина, специфический для классического биовара ген субъединицы В ( ctxB1 ). Были также обнаружены клоны одной из генетических особенностей, у которых было наличие в опероне ctxAB нового аллеля гена ctxB – ctxB7 [Kerketta, Kar, Khuntia, 2019] .

Холерный токсин (ХТ) является одним из основных факторов патогенности холерных вибрионов и определяет основные проявления холеры. Для выявления ХТ, как в РФ, так и за рубежом, используют генно-диагностические методы (амплификация, изотермическая амплификация и полногеномное секвенирование), которые относятся к косвенным методам и позволяют обнаружить у исследуемых штаммов генетическую детерминанту вирулентности – ген ХТ ( ctxAB ) [Lyon, 2001; Gubala, Proll, 2006; Koskela et al., 2009; Kim et al., 2015; Izumiya et al., 2019]. Применение генно-диагностических методов, несмотря на их высокую чувствительность и специфичность, имеет ряд ограничений, например, наличие генов, детерминирующих синтез ХТ, не всегда является показателем экспрессии самого токсина, кроме того, с помощью этих методов невозможно определить его количество и в какой форме он продуцируется. Этот показатель определяют с помощью высокочувствительных иммунохимических методов, в частности, иммуноферментного анализа (ИФА). В зарубежных публикациях отмечается, что ИФА-системы остаются наиболее используемыми и достоверными, при этом для обнаружения ХТ применяют различные варианты иммуноферментного анализа («сэндвич» вариант дот-ИФА, двойной «сэндвич»-ИФА) [Tuteja et al., 2007; Meza-Lucas et al., 2016; Bayat, Khabiri, Hemati, 2018].

В иммуноферментном анализе широко используют конъюгаты антител с пероксидазой хрена (ПХ), что обусловлено доступностью сырья для выделения этого фермента, относительной легкостью очистки и конъюгации, а также большим числом хромофорных и флюорохромных субстратов [Пирожков и др., 2010]. Однако данный фермент является чувствительным к ряду факторов, что приводит к потере его каталитической активности в процессе хранения и уменьшению способности антител связываться с соответствующим антигеном. Возможными причинами являются необратимое изменение конформации белковых молекул, модификация (например, окисление) функциональных групп белков, отвечающих за проявление каталитической активности или способности образовывать специфические иммунокомплексы, микробная контаминация и последующая деградация белков. Фермент имеет слабожесткую структуру и подвержен отрицательному влиянию внешних воздействий, в связи с чем срок его годности ограничен и составляет 6 месяцев, что обусловливает и низкий срок годности тест-системы в целом, в то время как срок годности остальных компонентов тест-системы в 2–3 раза выше [Пат. RU2232190C2 …, 2004]. В связи с этим существует необходимость подбора условий и методов, повышающих срок годности иммунопероксидазных конъюгатов, и разработки подходов к возможной стабилизации биологической активности фермента [Куклина и др., 2011]. Эффективным методом, увеличивающим стабильность таких препаратов, является лиофилизация. Известно, что присутствие в средах высушивания таких компонентов, как сыворотка эмбриона теленка [Кытманов и др., 2018], гидролизат птичьего альбумина [Пат. RU216.013.4820 …, 2015] в сочетании с 1%-ным поливинилпирролидоном и с 1%-ным тиосульфатом натрия [Загоскина и др., 2015], и/или 0.2 %-ным пропионатом кальция оказывает заметный стабилизирующий эффект. Введение сахарозы перед лиофилизацией конъюгатов предотвращает падение биологической активности пероксидазы и способствует образованию объемной таблетки при лиофилизации и хранении [Шаморова, 2009].

На базе ФКУЗ Ростовского-на-Дону противочумного института Роспотребнадзора получены экспериментальные серии пероксидазных конъюгатов на основе поли- и моноклональных антитоксических антител [Якушева и др., 2020а]. Эти препараты позволяют выявлять ХТ у токсигенных холерных вибрионов О1, О139 серогрупп.

Цель работы – оценить в процессе хранения физико-химическую и специфическую активность лио-фильно высушенных поли- и моноклональных пероксидазных конъюгатов, предназначенных для детекции ХТ в прямом варианте планшетного ИФА и дот-ИФА.

Материалы и методы исследований

В работе использовали 25 штаммов холерных вибрионов и 6 штаммов гетерологичных микроорганизмов, полученных из коллекции Музея живых культур с центром патогенных для человека вибрионов ФКУЗ Ростовского-на-Дону противочумного института Роспотребнадзора (табл. 1). Штаммы V. cholerae О1 и О139 с различным генотипом были подобраны согласно их паспортным данным.

Культуры вибрионов хранили в столбике полужидкого (0.3±0.1%) агара Мартена при температуре 20±2°C, культуры гетерологичных микроорганизмов – в 0.3%-ном полужидком мясо-пептонном агаре с рН 7.1–7.2. Все исследуемые штаммы были типичными по морфологическим, культуральным, биохимическим и серологическим свойствам.

Таблица 1

Варианты генотипов штаммов холерных вибрионов О1 и О139 серогрупп, использованные в работе [Genotype variants of O1 and O139 serogroup V. cholerae strains used in this study]

Штаммы	Генотип	Источник выделения	Год выделения^	Место выделения
Vibrio cholerae О1 серогруппы классического биовара
569B	ctxAВ1+, tcpA+	человек	1950	Индия
500	ctxAВ1+, tcpA+	-	1968	Пакистан
1763	ctxAВ1+, tcpA+	человек	1947	Индокитай
Vibrio cholerae О1 серогруппы Эль Тор биовара
1310	ctxAВ3+, tcpA+	человек	1966	Ирак, г. Багдад
3119	ctxAВ3+, tcpA+	человек	1970	г. Одесса
5879	ctxAВ3+, tcpA+	человек	1972	г. Таганрог
12214	ctxAВ3+, tcpA+	человек	1976	-
13020	ctxAВ3+, tcpA+	человек	1986	г. Азов
14383	ctxAВ3+, tcpA+	человек	1990	Ростовская обл. х. Колузаево
14455	ctxAВ3+, tcpA+	человек	1990	г. Ставрополь
14460	ctxAВ3+, tcpA+	человек	1990	г. Ставрополь
14464	ctxAВ3+, tcpA+	человек	1990	г. Ставрополь
Vibrio cholerae О1 серогруппы Эль Тор биовара (генова				рианты)
17917	ctxAВ1+, tcpA+	вода	1999	вода
19667	ctxAВ7+, tcpA+	человек	2014	г. Москва
Vibrio cholerae О139 серогруппы
16070	ctxAВ+, tcpA+	-	-	Индия
16063	ctxAВ+, tcpA+	человек	1993	Ростовская обл. г. Азов
16064	ctxAВ+, tcpA+	человек	1993	Ростовская обл. г. Азов
Vibrio cholerae О1 серогруппы Эль Тор биовара
19766	сtxАВ–, tcpА–	вода	2015	г. Элиста, пруд Заячий
19778	сtxАВ–, tcpА–	вода	2015	Иркутская обл. р. Ангара
19791	сtxАВ–, tcpА–	вода	2015	Краснодарский край, р. Агура
19813	сtxАВ–, tcpА–	человек	1998	г. Мариуполь
19875	сtxАВ–, tcpА–	вода	2015	г. Элиста, пруд Заячий
Vibrio cholerae О139 серогруппы
17675	сtxАВ–, tcpА–	вода	1997	г. Москва, р. Москва
17677	сtxАВ–, tcpА–	вода	1997	г. Москва, р. Москва
17678	сtxАВ–, tcpА–	вода	1997	г. Москва, р. Москва
Гетерологичные микроорганизмы
Escherichia сoli 1961		-	1965	-
Escherichia сoli 1962		-	1965	-
Aeromonas hydrophila Р-143		вода	1944	г. Ростов-на-Дону, р. Дон
Aeromonas hydrophila Р-1269		вода	1959	г. Санкт-Петербург, р. Нева
Salmonella typhimurium 1288		-	1960	г. Лондон
Salmonella typhimurium 4446		-	-	г. Лондон

В качестве источника токсина использовали супернатанты токсигенных штаммов. Исследования с применением патогенных биологических агентов II–III групп патогенности осуществляли согласно требованиям санитарных правил СП 3.3686-21 «Санитарно-эпидемиологические требования по профилактике инфекционных болезней», СП 1.3.2322-2008 «Безопасность работы с микроорганизмами III и IV групп патогенности (опасности) и возбудителями паразитарных болезней».

По отработанной схеме [Якушева и др., 2020б] были приготовлены экспериментальные образцы поли- и моноклональных пероксидазных конъюгатов для детекции ХТ в супернатантах токсигенных штаммов V. cholerae О1, О139 серогрупп. Конъюгаты на основе моноклональных антител имели рабочее раз- ведение 1:32, а поликлональные – 1:64, при этом их чувствительность в прямом варианте ТИФА и дот-ИФА равнялась 10 нг/мл.

Подбор оптимального стабилизатора осуществляли путем оценки четырех вариантов среды высушивания:

первый вариант (I) – 1%-ная сахароза, 1%-ный поливинилпирролидон, 0.5%-ный яичный альбумин; второй (II) – 1%-ная сахароза, 1%-ный тиосульфат натрия, 0.5%-ный яичный альбумин; третий (III) – 1%-ная сахароза, 1%-ный поливинилпирролидон, 0.5%-ный бычий сывороточный альбумин (БСА); четвертый (IV) – 1%-ная сахароза, 1%-ный тиосульфат натрия, 0.5%-ный БСА. Компоненты стабилизатора растворяли в фосфатно-солевом буфере pH 7.2 комнатной температуры при постоянном перемешивании. Полученный раствор фильтровали через фильтры Millipor с размерами пор 0.45 мкм с последующим добавлением в него равного объема конъюгата.

Жидкие пероксидазные антитоксические конъюгаты в защитной среде высушивания разливали по флаконам по 1 мл объемом 5 мл с резиновыми пробками и замораживали. Лиофилизацию проводили на аппарате для сублимационного высушивания Heto PowerDry PL9000,Thermo Scientific (Дания), в течение 11 ч., плавно изменяя температуру сушки с –25 до +30°С. Аналогичным образом лиофилизировали поли-и моноклональные пероксидазные конъюгаты к ХТ без добавления стабилизаторов. По окончании лиофилизации флаконы укупоривали в среде атмосферного воздуха. Готовый препарат хранили при 4°C.

Физические свойства поли- и моноклональных конъюгатов (растворимость, цветность, прозрачность, потеря в массе при высушивании) и иммунохимические (специфическая активность, чувствительность) контролировали до и после лиофилизации. Сроки хранения лиофилизированных конъюгатов оценивали в долгосрочных испытаниях через 6, 12, 18, 24 мес. в условиях сухого защищенного от света месте при температуре 4°С. Количественное определение белка проводили методом сравнения поглощения белков при 260 и 280 нм на приборе Bio-Rad SmartSpec Plus.

В опытах использовали одни и те же заведомо отрицательные и положительные пробы, аликвоты которых хранились при температуре –20°С. Специфическую активность и чувствительность проверяли на супернатантах токсигенных, нетоксигенных холерных вибрионов и гетерологичных микроорганизмов, которые получали в результате выращивания штаммов в среде AKI по стандартному методу M. Iwanaga [Iwanaga, Kuyyakanond, 1987]. Специфическую активность регидратированных конъюгатов определяли в прямом ТИФА и дот-ИФА.

Постановку дот-ИФА осуществляли на нитроцеллюлозной мембране (НЦМ) с диаметром пор 0.45 мм (Bio-Rad) [Якушева и др., 2020а].

Прямой ТИФА проводили в 96-луночных панелях «Costar» (USA), лунки которых сенсибилизировали в течение 2 ч. при 37°С соответствующими супернатантами в разведении 1:2 в 0.01 М фосфатно-солевом буфере (ФСБ), рН 7.4. В качестве положительного контроля использовали препарат очищенного ХТ 50 нг/мл [Алексеева и др., 2019], а отрицательным контролем являлась среда AKI. Неспецифическую сорбцию блокировали 1%-ным раствором БСА в течение 30 мин. при 37°С.

Для разведения конъюгата использовали 0.01 М ФСБ (рН 7.4) с добавлением 0.05%-ного Твин 20. Длительность инкубации токсинсодержащих образцов с конъюгатами не превышала 30 мин. После каждого этапа следовала процедура отмывания планшета ФСБ рН 7.4 от несвязавшихся компонентов реакции. Субстратом служили свежеприготовленные растворы ТМБ (3.3'.5.5'-тетраметилбензидин) и 0.03%-ной перекиси водорода в 50 мМ цитрат-фосфатном буфере (pH 5.0). Реакцию останавливали через 10 мин. добавлением в лунки 2 М раствора серной кислоты. Результаты ИФА регистрировали с помощью спектрофотометра «Bio Tek EL 800» (Bio Tek Instruments, США) при длине волны 450 нм (референсволна 630 нм). Все исследования проводили не менее чем в трех повторностях. При анализе результатов были использованы параметрические статистические методы (p < 0.05). [Ашмарин, Воробьев, 1962].

Результаты и их обсуждение

Приготовленные нами ранее [Якушева и др., 2020] экспериментальные образцы поли- и моноклональных пероксидазных конъюгатов для детекции ХТ в супернатантах токсигенных штаммов V. cholerae О1, О139 находились в жидком состоянии и хранились при 4°С. В этом случае сроки их эффективного использования ограничивались одной неделей, при хранении при температуре –20°С – шестью мес. Лиофильное высушивание поли- и моноклональных пероксидазных конъюгатов без стабилизатора не обеспечивало увеличения сроков их хранения.

Поэтому следующим этапом нашей работы был подбор стабилизирующей среды для лиофильного высушивания поли- и моноклональных пероксидазных антитоксических конъюгатов, способствующей сохранению их физико-химических свойств и специфической активности. Испытанию подверглись четыре варианта стабилизирующей среды. Подбор вариантов защитных сред базировался на результатах предварительных исследований, свидетельствующих о возможности использования традиционных компонентов: сахарозы, тиосульфата натрия, поливинилпирролидона, яичного и бычьего сывороточного альбумина, которые обеспечивают высокий уровень сохранности препаратов при различных режимах сушки. Как показали результаты ТИФА, рабочий титр и чувствительность моноклонального и поликлонального пероксидазного конъюгатов остались на исходном уровне после добавления к ним различных стабилизирующих сред. Согласно полученным данным, все вышеуказанные компоненты, входящие в состав сред, не препятствовали связыванию иммуноглобулинов с антигеном, а также обеспечивали возможность проникновения субстрата к активному центру пероксидазы.

Была проведена лиофилизация поли- и моноклональных пероксидазных конъюгатов к ХТ с использованием стабилизирующих сред и оценены их основные физико-химические и биологические показатели. Препараты после лиофилизации представляли собой гомогенную компактную массу в виде таблетки белого цвета, равномерно прилегающей к внутренней поверхности флакона, конъюгаты без стабилизатора имели серый оттенок. Остаточная влажность сухих конъюгатов не превышала 2%. После добавления необходимого объема растворителя (дистиллированная вода) лиофилизированные препараты хорошо без осадка растворялись в течение 1 мин. при температуре 20…25°С.

Регидратированные препараты представляли собой гомогенные, слабо опалесцирующие жидкости, от бесцветной до слабожелтой окраски, без хлопьев и комков. Результаты исследований показали снижение значений оптической плотности в прямом ТИФА для поли- и моноклональных пероксидазных конъюгатов, лиофилизированных без стабилизирующей среды. Аналогичную реакцию наблюдали и в отношении лиофилизатов первой и третьей стабилизирующих сред (табл. 2). В препаратах поли- и моноклональных конъюгатов, лиофилизированных без стабилизирующей среды, отмечено снижение содержания белка на 10.5±0.04 и 9.9±0.09% соответственно. Показатель потери белка конъюгатов после лиофилизации в первой и третьей стабилизирующих средах составил 5.5%. Минимальное снижение количества белка установлено в препаратах лиофилизатов второй и четвертой стабилизирующих сред. Последние, как показали результаты ИФА, в большей степени способствовали сохранности специфической активности препаратов, тогда как для первого и третьего вариантов сред было зарегистрировано её снижение.

Таблица 2

Оценка специфической активности и содержание белка в пероксидазных конъюгатах до и после лиофильного высушивания

[Assessment of specific activity and protein content of peroxidase conjugates before and after lyophilic drying]

	До лиофилизации			После лиофилизации
	Стабилизирующая среда	Содержание белка, %	ОП в ТИФА с с/н V. cholerae О1 El Tor ctx-AB +	Стабилизирующая среда	Потеря белка, % от общего содержания	ОП в ТИФА с с/н V. cholerae О1 El Tor ctxAB +
I 2 S * Ч 5S к ^	Отсутствует	8.4±0.12	1.543±0.02	Отсутствует	10.5±0.04	0.888±0.01
	I	9.5±0.08	1.545±0.02	I	5.5±0.04	1.268±0.05
	II	9.3±0.04	1.540±0.02	II	1.2±0.04	1.538±0.03
	III	9.4±0.08	1.544±0.02	III	5.4±0.04	1.248±0.04
	IV	9.3±0.20	1.539±0.02	IV	1.4±0.04	1.527±0.01
	Положительный контроль		1.680±0.02	Положительный контроль		1.665±0.01
	Отрицательный контроль		0.089±0.01	Отрицательный контроль		0.091±0.01
о а g § о О Й 2 я	Отсутствует	9.2±0.08	1.202±0.02	Отсутствует	9.9±0.09	0.719±0.01
	I	10.4±0.37	1.291±0.04	I	5.1±0.04	1.113±0.05
	II	10.2±0.12	1.298±0.01	II	1.3±0.09	1.268±0.02
	III	10.4±0.16	1.203±0.03	III	5.5±0.01	1.097±0.03
	IV	10.3±0.08	1.297±0.02	IV	1.1±0.03	1.268±0.01
	Положительный контроль		1.404±0.01	Положительный контроль		1.386±0.01
	Отрицательный контроль		0.089±0.01	Отрицательный контроль		0.083±0.02

Примечание. Представлены средние значения оптических плотностей (ОП) и стандартное отклонение.

При использовании в ИФА лиофилизированных конъюгатов без стабилизатора показатели ОП были ниже. Результаты проверки активности и специфичности в ТИФА на широком наборе штаммов показали, что до лиофильного высушивания поли- и моноклональные конъюгаты специфично реагировали с супернатантами токсигенных штаммов V. cholerae, при этом показатели ОП для V. cholerae О1 Classical ctxAB1+ и геновариантов, содержащих специфический для классического биовара ген (ctxAB1+) и ген (ctxAB7+), были 1.628±0.006 и 1.428±0.001 соответственно. Оптическая плотность лунок, сенсибилизированных супернатантами V. cholerae О1 El Tor, содержащих специфический для биовара El Tor ген ctxAB3+ и V. cholerae О139 ctxAB+ и инкубированных с поли- и моноклональными конъюгатами, находилась в пределах значений 0.585±0.003 и 0.412±0.007. Поли- и моноклональные конъюгаты не вступали в реакцию с супернатантами нетоксигенных штаммов и гетерологичными микроорганизмами, и тому подтверждение показатели ОП, равные 0.108±0.001 т.е. на уровне отрицательного контроля. Лиофилизированные во второй и четвертой стабилизирующих средах поли- и моноклональные конъюгаты при взаи- модействии с супернатантами V. cholerae О1 Classical ctxAB1+ и генетически измененными вариантами (ctxAB1+ и ctxAB7+) имели ОП 1.620±0.001 и 1.421±0.002, у V. cholerae О1 El Tor ctxAB3+ и V. cholerae О139 ctxAB+ ОП были 0.579±0.002 и 0.408±0.003. Эти значения сопоставимы с исходным уровнем активности препаратов. Положительная реакция также зарегистрирована в отношении поли- и моноклональных пероксидазных конъюгатов, лиофилизированных в первой и третьей стабилизирующих средах, однако при этом ОП значительно снизились. Так, для супернатантов штаммов V. cholerae О1 Classical ctxAB1+ и геновариантов (ctxAB1+ и (ctxAB7+) они находились в диапазоне 1.185±0.002 - 1.061±0.002. Для большей части супернатантов токсигенных штаммов ОП регистрировались в пределах 0.345±0.003 – 0.257±0.005, свидетельствуя о снижении активности конъюгатов после лиофилизации в первой и третьей стабилизирующих средах.

Экспериментальные образцы поли- и моноклональных конъюгатов до лиофильного высушивания и после него также были изучены в реакции дот-ИФА на широком наборе супернатантов штаммов V. cholerae O1. Их активность оценивали по интенсивности окрашивания пятен в местах нанесения ток-синсодержащих образцов после выполнения дот-иммуноанализа.

Результаты сравнительной оценки лиофилизатов поли- и моноклональных конъюгатов показали, что все конъюгаты до лиофилизации обладают способностью связываться с супернатантами токсигенных штаммов V. cholerae O1, что подтверждается наличием сигнала только в местах нанесения токсинсодер-жащих образцов. Отсутствие окрашенных пятен на НЦМ у супернатантов штаммов V. cholerae O1, не содержащих в геноме детерминант ХТ и супернатантов гетерологичных микроорганизмов – показатель отрицательной реакции дот-ИФА и свидетельство строгой специфичности конъюгатов.

Таблица 3

Определение специфической активности конъюгатов в ИФА после хранения в течение 6, 12, 18, 24 месяцев

[Determination of specific conjugate activity in ELISA after storage for 6, 12, 18, 24 months]

	Стабилизирующая среда	Температура хранения	Титр лиофилизированных конъюгатов в ИФА до хранения	Титр лиофилизированных конъюгатов в ИФА
				через 6 месяцев хранения	через 12 месяцев хранения	через 18 месяцев хранения	через 24 месяца хранения
о :S Й I « 2 S 4 д § § § к ® S	отсутствует	4°С	1:64	-	-	-	-
	I	4°С	1:64	1:64	1:32	1:16	1:8
	II	4°С	1:64	1:64	1:64	1:64	1:64
	III	4°С	1:64	1:64	1:32	1:16	1:16
	IV	4°С	1:64	1:64	1:64	1:64	1:64
О « 8 5 л g 1 §	отсутствует	4°С	1:32	-	-	-	-
	I	4°С	1:32	1:32	1:16	1:16	1:8
	II	4°С	1:32	1:32	1:32	1:32	1:32
	III	4°С	1:32	1:32	1:16	1:16	1:8
	IV	4°С	1:32	1:32	1:32	1:32	1:32

Примечание. - реакция отрицательная.

Взаимодействие супернатантов токсигенных штаммов V. cholerae O1 с поли- и моноклональными конъюгатами, лиофилизированными во второй и четвертой стабилизирующих средах, сопровождалось появлением коричневых пятен на НЦМ. В то же время интенсивность реакции дот-ИФА снижалась, если супернатанты токсигенных штаммов V. cholerae O1 вступали в реакцию с поли- и моноклональными конъюгатами, лиофилизированными в первой и третьей стабилизирующих средах, в которых наряду с сахарозой, БСА или яичным альбумином, присутствовал поливинилпирролидон, в отличие от второй и четвертой, содержащих тиосульфат натрия.

Аналогичные результаты с супернатантами токсигенных штаммов V. cholerae O1 получены в реакции дот-ИФА при использовании поли- и моноклональных конъюгатов, лиофилизированных в среде без стабилизатора, и проявлялась она в виде менее окрашенных пятен. Необходимо также отметить отсутствие сигнала реакции у всех исследуемых лиофилизатов с супернатантами нетоксигенных штаммов V. chol-erae O1 и представителями гетерологичных микроорганизмов.

Представляла также практический интерес оценка стабильности лиофилизированных конъюгатов в процессе хранения в течение 6, 12, 18, 24 мес. при 4°С. Результаты в ИФА показали, что лиофилизированные конъюгаты сохраняли исходную специфическую активность при использовании второй и четвертой стабилизирующих сред (табл. 3). Показатели титров конъюгатов в этом случае оставались на исходном уровне. Хранение поли- и моноклональных конъюгатов, лиофизированных в первой и третьей защитных средах, сопровождалось снижением рабочего титра до 1:8–1:16.

Заключение

Таким образом, на основании данных, полученных в долгосрочных испытаниях, можно рекомендовать срок использования поли- и моноклональных конъюгатов в лиофилизированной форме в течение двух лет. Экспериментально доказано, что в течение этого периода времени серологические и физикохимические показатели лиофилизированных конъюгатов в защитной среде, содержащей 1% сахарозы, 1% тиосульфата натрия, 0.5% яичного альбумина или 0.5% БСА, остаются на уровне, соответствующем требованиям, предъявляемым к диагностическим препаратам.