Условно-рефлекторная деятельность потомства первого поколения от самцов крыс, подвергшихся острому воздействию G-излучения в дозе 1 Гр (сообщение 1)

В последние годы стала актуальной проблема выяснения физиологической полноценности внешне здоровых детей – потомков отцов, облучённых в дозах, не приводящих даже к временной стерильности. Данные по этой тематике противоречивы. В ряде работ, при психологическом обследовании детей ликвидаторов последствий аварии на Чернобыльской АЭС, было выявлено некоторое снижение интеллекта, даже у детей без выраженных пороков развития [1, 2]. Однако обследование детей и внуков работников радиохимического предприятия в России не выявило значительных нарушений в их развитии [3]. Кроме того, существует мнение, что веской причиной плохого состояния здоровья детей ликвидаторов являются нерадиационные факторы [4]. Одним из способов получения достоверной информации по этому направлению являются экспериментальные исследования на животных. В работе [5] нами было представлено состояние проблемы по этой тематике и оценено влияние однократного облучения в нестерилизующей дозе 1,5 Гр самцов крыс на психофизиологическое развитие их потомства первого и второго поколений. Важную научную и практическую значимость имеет экспериментальная оценка порогового уровня облучения, индуцирующего выявленные в указанной работе [5] нарушения. С учётом этого, целью данной работы являлось изучение влияния острого воздействия у -облучения самцов крыс Вистар в меньшей дозе (1,0 Гр) на разных стадиях сперматогенеза на способность к обучению их потомства F1.

Панфилова В.В.* - аспирант; Колганова О.И. - ст. научн. сотр., к.б.н.; Жаворонков Л.П. - зам. директора по научн. работе, д.м.н.; Павлова Л.Н. - вед. научн. сотр., к.м.н.; Иванов В.Л. - ст. научн. сотр., к.вет.н.; Палыга Г.Ф. - гл. научн. сотр., д.м.н. ФГБУ МРНЦ Минздрава России.

Методика

Половозрелых самцов крыс (F0) облучали ионизирующим излучением (установка «Луч», мощность дозы 0,003 Гр/с) и спаривали с интактными самками из расчёта 1 самец на 2 самки через разные интервалы времени после облучения, чтобы в оплодотворении участвовали половые клетки, облучённые на премейотической (сперматогонии) и постмейотических (сперматиды и сперматозоиды) стадиях сперматогенеза.

Ранее нами были подтверждены данные других исследователей [6], что способность к обучению у потомков в значительной степени зависит от способностей их родителей к обучению, и выяснено методическое значение этого обстоятельства для ряда радиобиологических опытов [7]. Поэтому до начала основной стадии эксперимента в предварительных опытах нами было протестировано по критерию выработки условного рефлекса избегания (УРИ) достаточное количество интактных самок и самцов, чтобы сформировать равноценные по исходной способности к обучению контрольные и подопытные родительские группы. В каждую группу входило примерно равное количество хорошо обучающихся и плохо обучающихся самок и самцов, все животные имели индивидуальные метки.

В соответствии с циклом сперматогенного эпителия [8, 9] для того, чтобы в оплодотворении участвовали облучённые сперматозоиды, самцов подсаживали к самкам на 5-7 сутки после облучения. Для участия в оплодотворении облучённых сперматид самцов подсаживали к самкам на 16-22 сутки после облучения. Для участия в оплодотворении облучённых сперматогони-ев самцов подсаживали к самкам через три месяца после облучения. Соответственно, потомство первого поколения было поделено на 3 подопытные группы («сперматозоиды», «сперматиды», «сперматогонии»). Наступление беременности верифицировали стандартным способом -по наличию сперматозоидов во влагалищном мазке.

В работах Суринова Б.П. с соавторами было показано [10, 11], что на интактных животных реальное воздействие могут оказывать летучие компоненты выделений облучённых животных (в частности, в наших опытах - облучённых самцов). Чтобы самок из контрольных и подопытных групп поставить в близкие условия, на период спаривания помещали клетки с контрольными животными на один стеллаж с подопытными в пределах предполагаемого воздействия летучих выделений. После оплодотворения самок опытных и контрольных групп рассаживали по одной в чистые клетки и помещали в комнату, где не было самцов.

В подопытные и контрольные группы для тестирования условно-рефлекторной деятельности из числа выживших потомков первого поколения в возрасте трёх месяцев отбирали по два внешне здоровых детеныша (самца и самку) от каждой самки-матери. Тестирование проводили дважды с интервалом в двое суток отдельно для групп самцов и самок.

Когнитивные (памятные) функции мозга оценивали по способности к выработке и воспроизведению УРИ. В экспериментах использовали стандартную методику обучения крыс в челночной камере Шаттл-бокс [12]. Данный метод позволяет судить о таких элементах высшей нервной деятельности, как закрепление условных связей и воспроизведение выработанного навыка, эмоциональное поведение и развитие стресса. В трёхканальной камере тестировали крыс с определённой последовательностью сигналов: свет+звук (условный сигнал) - 4 с, болевое электрическое раздражение (безусловный сигнал) - с 4 по 12 с; пауза - 20 с. За один сеанс крысам предъявляли по 50 сочетаний условного и безусловного раздражителей.

При анализе выработки и воспроизведения УРИ использовали ряд показателей, отражающих конечную результативность обучения (интегративные критерии), либо характеризующих скорость обучения (динамические критерии).

К интегративным критериям относили:

• 1)    число нанесённых током ударов до регистрации первого УРИ - лаг-фаза обучения;

• 2)    общее число УРИ за сессию;

• 3)    количество перебежек в другой отсек после удара током;

• 4)    число отказов (отсутствие перебежек даже на электрокожное подкрепление);

• 5)    наличие крыс, имеющих серии из пяти и более УРИ подряд (критерий оценки состояния консолидации памятного следа);

• 6)    среднее по группе значение латентного периода реакции избегания либо перебежки.

Показатели скорости обучения основаны на оценке параметров кривых линейной регрессии, отражающих нарастание частоты избеганий в процессе обучения. Регрессионный анализ позволяет количественно оценить различия в исходном уровне обученности и скорости обучения (по коэффициентам уравнений регрессии).

С помощью уравнений линейной регрессии оценивали:

• 1)    динамику количества УРИ в процентах к максимально возможному за интервал в десять попыток с шагом в две попытки индивидуально у каждой крысы и в целом по группе;

• 2)    при использовании в качестве функции отношения числа УРИ к числу совершённых попыток вычисляли также критерий 50% обученности (ОБ-50) с доверительным интервалом (число попыток до появления 50% УРИ в среднем у каждой крысы в группе);

• 3)    среднее число попыток до появления первого условного рефлекса у половины крыс в группе (условное название показателя - «доля крыс»), этот показатель в сравнении с ОБ-50 позволяет оценить однородность группы (при отсутствии резкого расслоения группы показатель «доля крыс» бывает примерно вдвое меньше показателя ОБ-50). Кроме того, использовали двухфакторный дисперсионный анализ, который по критериям Фишера позволяет оценить влияние на конечный результат фактора воздействия и фактора обучения.

Статистическую обработку полученных результатов проводили с использованием ряда методов параметрической (t-критерий Стьюдента) и непараметрической (медианный критерий кси-квадрат, Х-критерий Ван дер Вардена, U-критерий Вилкоксона-Манна-Уитни) статистики. Значимость различий считалась достаточной при p<0,05.

Результаты

У самцов первого поколения (F1) по результатам первого тестирования (табл. 1, 2) во всех подопытных группах зарегистрировано значительно больше отказов от перебежек, чем в контрольной группе, с гораздо более низкой скоростью (коэффициенты В уравнения регрессии), нарастало количество условных рефлексов во время обучения у групп «сперматозоиды» и «сперматиды», соответственно, для достижения равного с контролем уровня обученности этим подопытным группам требовалось значительно больше сочетаний условного и безусловного стимулов, чем контрольной группе (показатель ОБ-50).

Таблица 1

Интегративные показатели результативности обучения крыс первого поколения по результатам первого тестирования

Группа	Лаг-фаза	Количество УРИ за сессию	Количество отказов	Латентный период УРИ (с)	Латентный период перебежек (с)	Число крыс с сериями УРИ
Самцы F1
Биологический контроль (n=42)	17,7±2,1	8,1±1,2	5,8±0,9	2,7±0,1	6,0±0,1	7/42 (17%)
«Сперматозоиды» (n=24)	20,7±2,6	5,4±0,9*	8,4±1,8*	2,5±0,1	6,4±0,1*	4/24 (17%)
«Сперматиды» (n=21)	19,1±3,5	5,7±1,0	7,2±1,6*	2,9±0,1	6,0±0,1	1/21 (5%)
«Сперматогонии» (n=21)	12,9±2,8	10,3±1,8	8,1±1,5*	2,1±0,1*	6,0±0,1	5/21 (24%)
Самки F1
Биологический контроль (n=33)	18,6±2,6	9,5±1,4	5,3±1,0	2,6±0,1	6,0±0,1	9/33 (27 %)
«Сперматозоиды» (n=20)	13,4±2,6	8,8±1,5	3,4±0,9	2,5±0,1	5,7±0,1	2/20 (10 %)
«Сперматиды» (n=21)	21,9±3,4	10,1±2,2	0,8±0,3*	2,4±0,1	5,7±0,1	7/21 (33 %)
«Сперматогонии» (n=21)	14,8±3,2	9,8±1,6	6,5±1,4	2,0±0,1*	6,0±0,1	4/21 (19 %)

Примечание: n – количество животных; * – значимое различие с контролем при р≤0,05.

Таблица 2

Показатели скорости обучения крыс первого поколения по результатам первого тестирования

Группа	«Доля крыс»	ОБ-50 (шаг 2)	Уравнение регрессии нарастания УРИ по попыткам		Критерии Фишера
			коэффициент β	коэффициент α	Ф1	Ф2
Самцы F1
Биологический контроль (n=42)	75,6±3,7	169±18	1,36±0,11	0,63±1,40
«Сперматозоиды» (n=24)	102,6±7,1*	253±16*	1,04±0,09*	– 1,52±1,19	7,29*	51,9*
«Сперматиды» (n=21)	127,0±13,3*	320±43*	0,81±0,11*	2,06±1,38	7,00*	10,4*
«Сперматогонии» (n=21)	61,3±3,1	134±10	1,83±0,17*	– 0,23±2,18	7,96*	0,17
Самки F1
Биологический контроль (n=33)	63,0±2,4	137,7±14,8	1,75±0,14	– 0,72±1,71
«Сперматозоиды» (n=20)	80,0±4,9*	189,7±18,9*	1,19±0,14*	4,08±1,79*	6,30*	22,1*
«Сперматиды» (n=21)	58,8±2,4	117,2±8,3	1,90±0,20	– 0,89±2,46	6,14*	89,3*
«Сперматогонии» (n=21)	66,0±3,9	163,0±15,8	1,54±0,16	1,74±2,03	6,11*	0,05

Примечание: здесь и далее Ф1 – фактор обучения, Ф2 – фактор ионизирующего облучения; n – количество животных; * – значимое различие с контролем при р≤0,05.

Во время второго тестирования (более информативного, чем первое) расхождение между контрольной группой самцов F1 и группами «сперматозоиды» и «сперматиды» ещё более усугубилось (табл. 3 и рис. 1А): за вторую сессию обучения у подопытных групп выработалось значительно меньше условных рефлексов, чем в контроле; выявились нарушения как в краткосрочной, так и в долгосрочной памяти – крысы этих подопытных групп начали повторное обучение с более низких стартовых позиций, чем контрольная группа, то есть они не запомнили выученный два дня назад «урок»; при повторном обучении у этих крыс было меньше серий из пяти УРИ подряд. В группе «сперматогонии» существенных отличий от контроля выявлено не было, за исключением статистически значимого увеличения числа отказов от перебежки даже на электрокожное подкрепление, что является одним из признаков стресса.

Таблица 3

Интегративные показатели результативности обучения крыс первого поколения по результатам второго тестирования

1.0 Гр., 2 тест, самцы F1

I— О •

K

1.0 Гр., 2 тест, самки F1

K

0      5     10     15     20     25

Порядковый номер шага

1--------------1--------------1--------------1--------------1--------------1--------------1--------------1--------------1--------------1--------------1

0      5     10     15    20    25

Порядковый номер шага

Группа	Лаг-фаза	Количество УРИ за сес сию	Количество отказов	Латентный период УРИ (с)	Латентный период перебежек (с)	Число крыс с сериями УРИ
Самцы F1
Биологический контроль (n=42)	3,8±0,8	25,5±1,9	2,9±0,7	2,6±0,1	5,6±0,1	30/42 (71 %)
«Сперматозоиды» (n=24)	10,0±2,8*	15,4±2,0*	10,3 ±1,9*	2,4±0,1	6,2±0,1*	8/24* (33%)
«Сперматиды» (n=21)	9,8±3,0	15,3±2,4*	6,6 ±1,2*	2,5±0,1	6,0±0,1	9/21 (43%)
«Сперматогонии» (n=21)	4,8±1,5	23,4±2,3	7,2 ±2,0*	2,2 ±0,1*	5,6±0,1	14/21 (67%)
Самки F1
Биологический контроль (n=33)	6,1±1,5	24,8±2,2	2,7±0,6	2,6±0,1	5,8±0,1	23/33 (70%)
«Сперматозоиды» (n=20)	10,4±3,0	20,6±3,0	2,2±0,9	2,4±0,1	5,5±0,1	11/20 (55%)
«Сперматиды» (n=21)	5,8±1,6	24,4±2,6	0,9±0,4	2,4±0,1	5,3±0,1	16/21 (76%)
«Сперматогонии» (n=21)	9,4±2,6	20,3±2,6	3,1±0,7	2,1±0,1*	5,4±0,1	11/21 (52%)

Примечание: n - количество животных; * - значимое различие с контролем при р<0,05.

А Б

Рис. 1. Динамика нарастания количества УРИ (% к максимально возможному числу УРИ за 10 попыток с шагом в 2 попытки) в процессе обучения самцов (А) и самок (Б) первого поколения в процессе второго тестирования. К - контрольная группа, 1 - группа «сперматозоиды», 2 - группа «сперматиды», 3 - группа «сперматогонии».

У самок F1 при первом тестировании только в группе «сперматозоиды» были отмечены значительные отклонения от контроля в худшую сторону: меньшая скорость обучения и соответственно более высокий показатель ОБ-50 (табл. 2). При повторной сессии обучения были обнаружены нарушения в долгосрочной памяти в группах «сперматозоиды» и «сперматогонии» (табл. 3, 4 и рис. 1Б): крысы из подопытных групп плохо запомнили предыдущий «урок»: за последние 10 попыток при первом тестировании у контрольных крыс выработалось в среднем 3,6 УРИ, у группы «сперматозоиды» - 3,3 УРИ, у группы «сперматогонии» - 3,9 УРИ; а во время первых 10 попыток при втором тестировании (через двое суток) в этих группах число УРИ соответственно составило 2,8; 1,8 и 1,5. По показателям скорости обучения заметное отставание от контрольной группы наблюдалось у крыс из группы «сперматогонии». У крыс подопытных групп отмечались также признаки эмоционального стресса, выражавшиеся в частых межсигнальных перебежках.

Таблица 4

Показатели скорости обучения крыс первого поколения по результатам второго тестирования

Группа	«Доля крыс»	ОБ-50 (шаг 2)	Уравнение регрессии нарастания УРИ по попыткам		Критерии Фишера
			коэффициент β	коэффициент α	Ф1	Ф2
Самцы F1
Биологический контроль (n=42)	24,5±0,9	46,4±4,1	2,13±0,17	28,1±2,1
«Сперматозоиды» (n=24)	44,9±2,0*	85,4±4,8*	2,24±0,18	6,0±2,3*	5,06*	274,1*
«Сперматиды» (n=21)	46,6±2,7*	92,4±8,1*	1,99±0,20	7,9±2,6*	5,34*	139,5*
«Сперматогонии» (n=21)	28,2±1,1	54,3±4,1	2,46±0,22	19,6±2,8*	5,50*	20,6*
Самки F1
Биологический контроль (n=33)	26,0±0,7	50,4±6,6	2,13±0,19	25,9±2,3
«Сперматозоиды» (n=20)	34,3±1,8*	63,9±7,1	2,04±0,25	18,7±3,2	5,21*	- 0,001
«Сперматиды» (n=21)	26,5±1,2	49,4±3,4	2,63±0,22	20,9±2,8	6,01*	30,5*
«Сперматогонии» (n=21)	34,3±1,6*	62,9±4,8*	2,29±0,23	16,3±2,9*	6,18*	0,16

Примечание: n – количество животных; * – значимое различие с контролем при р≤0,05.

Двухфакторный дисперсионный анализ, выявляя количественное влияние каждого из двух воздействующих факторов (обучение и облучение) на динамику уменьшения вариабельности численных значений времени реакции на раздражители, позволяет оценить также и совокупные результаты указанных воздействий, которые могут быть одно- и разнонаправленными. При использовании двухфакторного дисперсионного анализа (табл. 2 и 4) было обнаружено, что фактор обучения Ф1 (F-критерий Фишера) действовал на все подопытные группы примерно в равной степени значимости по сравнению с контролем, тогда как влияние фактора ионизирующего облучения Ф2 (критерий Фишера) было выражено неодинаково. При первом тестировании значимые различия с контролем были обнаружены у самок и самцов из групп «сперматозоиды» и «сперматиды», на группу «сперматогонии» фактор облучения практически не повлиял. При повторном тестировании было выявлено значительное воздействие фактора Ф2 на условно-рефлекторную деятельность самцов не только из групп «сперматозоиды» и «сперматиды», но и из группы «сперматогонии», что согласуется с повышенным количеством отказов у этих групп животных по сравнению с контролем во второй сессии тренировок. У самок значимые различия с контролем по критерию Ф2 при повторном тестировании сохранились только в группе «сперматиды».

Заключение

В результате исследований было выявлено негативное влияние облучения родителей на высшую нервную деятельность их потомков. Так, при воздействии 1 Гр на крыс-отцов снизилась способность к обучению практически у всех потомков-самцов первого поколения, причём, более выраженные нарушения условно-рефлекторной деятельности выявлены у потомков-самцов, родившихся из яйцеклеток, оплодотворённых мужскими гаметами, облучёнными на гаплоидных стадиях сперматогенеза (сперматозоиды и сперматиды). У потомков-самок ухудшение способности к обучению было выражено в меньшей степени, чем у самцов. Следует отметить выра- женные признаки эмоционального стресса у самцов и самок подопытных групп: нарушения стабильности воспроизведения выработанных УРИ во второй половине сессии тестирования, повышенная реактивность на условные и безусловные стимулы (писк, двигательное беспокойство, частое бессистемное метание по камере), ступор (отказы от перебежек даже при ударе током), частые межсигнальные перебежки.

Полученные данные по условно-рефлекторной деятельности животных первого поколения из групп «сперматозоиды» и «сперматиды» хорошо согласуются с показателями антенатального развития этих групп крысят [1]. У данной категории животных было значимо снижено число живых новорождённых в помёте в расчёте на одну самку. Однако постнатальное развитие крысят из этих подопытных групп (по физическим параметрам) не отличалось от развития контрольных животных. В нашей работе исследование когнитивных функций мозга позволило выявить значительные нарушения психического развития внешне здоровых животных. В группе «сперматогонии» [13] при исследовании внутриутробного развития была отмечена только тенденция к увеличению внутриутробной гибели плодов (за счёт повышенной предимплантацион-ной гибели), других отклонений в антенатальном и раннем постнатальном онтогенезе не выявлено. Однако в настоящей работе обнаружены отклонения от нормального развития высшей нервной деятельности у животных из группы «сперматогонии», а именно: нарушение кратковременной и долговременной памяти.

Таким образом, при облучении самцов-родителей в дозе 1 Гр повреждения генетического материала гамет возникают на всех стадиях сперматогенеза и передаются потомкам в виде снижения когнитивных функций мозга.

Поскольку нижний порог доз ионизирующего излучения, вызывающий описанные выше нарушения условно-рефлекторной деятельности, ещё не найден, целесообразно оценить эффекты от более низких доз, чем использованные нами в данной работе.