Усовершенствование методов создания гибридов капусты белокочанной
Автор: Минейкина Анна Игоревна, Бондарева Людмила Леонидовна, Шумилина Дарья Владимировна, Домблидес Елена Алексеевна, Солдатенко Алексей Васильевич
Журнал: Овощи России @vegetables
Рубрика: Селекция и семеноводство сельскохозяйственных растений
Статья в выпуске: 4 (48), 2019 года.
Бесплатный доступ
Актуальность Одним из основных направлений селекции капустных культур является создание гетерозисных гибридов F1 с комплексом хозяйственно ценных признаков. Этот процесс является длительным и трудоемким, поскольку для получения выровненных линий необходимо в течение 6-12 лет проводить инбридинг. При этом не каждая линия дает желаемый гетерозисный эффект, что, в свою очередь, требует дополнительной проверки. Методика Для ускорения некоторых этапов селекционного процесса в работе использовали биотехнологический метод культуры изолированных микроспор in vitro, который позволяет уже в первом поколении получать линии со 100% гомозиготностью. Комбинационную способность определяли в системе полных диаллельных скрещиваний по основным морфологическим признакам. Результаты В результате работы оптимизирован состав питательной среды культуры изолированных микроспор in vitro и индивидуально подобран для каждого генотипа капусты белокочанной для наибольшего выхода эмбриоидов. Максимальный выход эмбриоидов был получен на среде с рН 6,2 с использованием ампициллина 100 мг/л и зеатина 1 мг/л и составил 466,7±153,2 шт./100 бутонов...
Капуста белокочанная, гетерозисные гибриды, культура изолированных микроспор in vitro, удвоенные гаплоидные линии, гомозиготность, самонесовместимость, комбинационная способность
Короткий адрес: https://sciup.org/140240732
IDR: 140240732 | DOI: 10.18619/2072-9146-2019-4-3-7
Текст научной статьи Усовершенствование методов создания гибридов капусты белокочанной
Одной из приоритетных задач отечественной селекции капустных культур является создание качественных сортов и гибридов в кратчайшие сроки, при этом отличающихся разнообразием, выров-ненностью, устойчивостью к болезням. Наиболее сложным, трудоемким и продолжительным этапом в этом процессе является создание константных родительских линий, на получение которых при использовании традиционных методов селекции уходит от 7 до 14 лет [1,2]. В настоящее время в современной селекции активно используют различные методы, позволяющие ускорить селекционный процесс. Одним из таких методов является биотехнологический метод культуры изолированных микроспор in vitro, который позволяет ускорить процесс создания F1 гибридов в 2 раза. Данный метод не только обеспечивает гомозиготность получаемых удвоенных гаплоидов, но и способствует расширению спектра формообразования генетических рекомбинантных форм, в том числе с рецессивными признаками. Получение стабильных гомозиготных линий из популяции облегчает поиск редких генотипов [3]. Несмотря на успехи биотехнологии в этой области, универсальной технологии получения удвоенных гаплоидов у различных растений рода Brassica не существует в силу генотипической зависимости в отзывчивости к андрогенезу. В основном используют базовые протоколы для растений рода Brassica, описанные ранее, которые постоянно оптимизируют под конкретные генотипы [4].
При этом крайне мало информации по внедрению полученных линий удвоенных гаплоидов капустных культур в селекционный процесс [5].
Цель исследования – усовершенствование метода культуры изолированных микроспор in vitro для наибольшего выхода эмбриоидов и использование полученных удвоенных гаплоидных растений в селекционном процессе капусты белокочанной.
Материалы и методы исследования
Работу выполняли в период с 2014 по 2018 годы в ФГБНУ ФНЦО. В качестве исходного материала для исследования были использованы:
-
1. Селекционные образцы капусты белокочанной лаборатории селекции и семеноводства капустных культур.
-
2. Растения-регенеранты капусты белокочанной, полученные в культуре изолированных микроспор in vitro в лаборатории биотехнологии.
Выращивание растений.
Донорные растения, выращенные в полевых условиях, отбирали в стадии технической спелости кочана по основным признакам согласно методическим рекомендациям. Яровизацию проводили в холодильной камере с температурой 4...6 ° С в течение 2-х месяцев. Акклиматизацию, получение цветоноса и скрещивание проводили в климатической камере при температуре 16.. ,18 ° С при режиме 16 ч - день/ 8 ч – ночь и освещении 9000 лк [6].
Определение стадии развития микроспор. Цитологическое исследование стадий развития микроспор проведено по методике дифференциального окрашивания [7] с помощью микроскопа Axio Imager А2.
Культура микроспор. Получение растений-регенерантов методом культуры изолированных микроспор проводили согласно методических рекомендаций [8]. В качестве питательных сред использовали модифицированные базовые среды. Микроспоры, выделенные из стерильных бутонов размером 45 мм, инкубировали в среде Лихтера с половинным содержанием компонентов (ЅNLN), рН 5,8 [9] в течение 2-х суток в темноте при 32°С, далее при 25°С до образования эмбриоидов. При достижении эмбриоидами стадии крупных глобул, сердцевидной или торпедовидной фазы их помещали в чашки Петри на среду Гамборга (В5) [10]. При обра- зовании побегов их отделяли и переносили на среду ЅМС [1 1]. Растения, у которых были нормально развиты листья и корневая система, переносили в вегетационные сосуды. Адаптацию и выращивание растений-регенерантов проводили в тех же условиях, что и донорные [12].
Оценка полученного материала на основные хозяйственно ценные признаки. Полевые опыты закладывали на опытных полях ФГБНУ ФНЦО, подготовленных по стандартной для овощных культур агротехнике [13]. Посев семян проводили в третьей декаде апреля в кассеты с диаметром ячейки 5х5 см. В третьей декаде мая рассаду высаживали в открытый грунт. Схема посадки 70х50 см.
Оценку полученных гибридных комбинаций капусты белокочанной осуществляли по основным хозяйственно ценным признакам в стадии технической спелости кочана. Анализ комбинационной способности родительских линий определяли в системе полных диаллельных скрещиваний по Гриффингу методом 1 [14].
Биохимические анализы проводили в лаборатории применения агрохимических средств в семеноводстве овощных культу ФГБНУ ФНЦО по общепринятым методикам [15].
Оценка устойчивости к основным болезням и вредителям. Оценку устойчивости растений капусты белокочанной осуществляли визуально в полевых условиях на естественном фоне в стадии технической спелости кочана. Оценку пораженности килой растений капусты белокочанной – на искусственном инфекционном фоне в открытом грунте в лаборатории иммунитета и защиты растений ФГБНУ ФНЦО [16, 17].
Обработку данных проводили методом дисперсионного анализа по Доспехову [13] с помощью прикладных программ Excel пакета Microsoft Office.
Таблица 1. Степень проявления самонесовместимости линий капусты белокочанной Table 1. The degree of manifestation of self-incompatibility lines of cabbage
Популяция растений-регенерантов |
Степень проявления самонесовместимости |
Всего |
|||||
Высокая |
Средняя |
Отсутствует |
|||||
шт. |
% |
шт. |
% |
шт. |
% |
||
1 |
3 |
27 |
1 |
9 |
7 |
64 |
11 |
2 |
4 |
40 |
4 |
40 |
2 |
20 |
10 |
11 |
2 |
40 |
3 |
60 |
0 |
0 |
5 |
5 |
2 |
50 |
0 |
0 |
2 |
50 |
4 |
3 |
3 |
50 |
3 |
50 |
0 |
0 |
6 |
Результаты исследований
Влияние состава питательной среды на выход эмбриоидов
Для опытов были использованы различные питательные среды, которые отличались кислотностью, наличием регуляторов роста и развития растений, антибиотиков. В качестве донорных растений в работе использовали 18 сортообразцов капусты белокочанной среднепозднего и позднего сроков созревания селекции ФНЦО.
Для изучения влияния кислотности на образование эмбриоидов капусты белокочанной были использованы среды с рН 5,8; 6,2; 6,6. В результате серии опытов было показано, что значение рН среды оказывает влияние на выход эмбриоидов отдельных генотипов. При этом все используемые генотипы по-разному реагируют на значение данного показателя питательной среды. Разная реакция сортотипов капусты белокочанной на кислотность питательной среды свидетельствует о необходимости проведения подбора параметров инкубирования для каждого генотипа индивидуально. В качестве антибиотика для предотвращения контаминации в культуре микроспор был использован ампициллин.
В работах ряда авторов отмечено положительное влияние на морфогенез капусты белокочанной использования в различных соотношениях в питательной среде цитокининов и ауксинов [18,19]. В ходе исследований было изучено влияние на процесс эмбриогенеза ряда регуляторов роста и развития растений: цитокининов (кинетин и зеатин) и ауксина (индолил уксусная кислота). В качестве контроля использовали безгормональную среду. В опыте использовали те генотипы капусты белокочанной, которые ранее не отозвались на безгормональной среде. Максимальный выход эмбриоидов был отмечен на среде с использованием зеатина в концентрации 1 мг/л и составил 466,7±153,2 шт./100 бут. Во всех вариантах прослеживается генотипическая зависимость на данный фактор. Возможно, для каждого отдельного генотипа необходимо индивидуально подбирать концентрации гормонов для наибольшего выхода эмбриоидов.
Таким образом, в результате проведенных опытов нами были подобраны среды для каждого изученного генотипа капусты белокочанной, которые способствовали наибольшему выходу эмбриоидов.
Полученные в культуре микроспор растения-регенеранты были протестированы на плоидность. Для дальнейшей селекции были использованы лишь удвоенные гаплоидные растения.
Оценка степени проявления самонесовместимости популяций растений-регенерантов
Важным этапом при работе с растениями капусты белокочанной является определение степени само-несовместимости, которая опреде-


Рис.1. Перспективная гибридная комбинация капусты белокочанной
Fig.1. Perspective hybrid of cabbage
ляет их дальнейшее использование в селекционном процессе. Данный показатель определяли по завязы-ваемости семян в стручках при самоопылении цветков: высокая – завязы-ваемость 0-1 шт/стручок, средняя – средняя 2-5 шт/стручок, низкая или отсутствует – более 5 шт/стручок (табл. 1) [20].
Показано, что каждая популяция содержала растения-регенеранты с высокой степенью самонесовмести-мости. Поэтому в дальнейшей работе была использован метод получения гибридов на основе самонесовме-стимости.
Составление модели F 1 гибрида капусты белокочанной
Для оценки полученных гибридных комбинаций капусты белокочанной нами была составлена модель F1 гибрида. Гибриды должны соответствовать следующим параметрам: поздний срок технической спелости, с периодом вегетации 120-130 суток от высадки рассады, дружный в созревании, транспортабельный, пригодный для механизированной уборки. Кочан средней величины, округлой формы, плотный, массой 2,5-3,5 кг, с отличной внутренней структурой, небольшой внутренней кочерыгой; содержание сухого вещества – 9-10 %, с высоким содержани- ем витамина С, сахаров и низким уровнем нитратов; устойчивый к основным болезням и вредителям.
Изучение комбинационной способности линий удвоенных гаплоидов капусты белокочанной
Для определения селекционной ценности 14 перспективных линий удвоенных гаплоидов капусты белокочанной проводили их диаллельное скрещивание. Оценку осуществляли по общей и специфической комбинационной способности по признакам: средняя масса кочана, средний диаметр розетки листьев, средняя высота наружной кочерыги, средняя длина внутренней кочерыги.
Селекция гетерозисных гибридов капусты белокочанной в конечном итоге сводится к созданию линий, которые обладают высокими значениями ОКС, сочетающими комплекс хозяйственно ценных признаков (табл.2).
Для селекции на высокую урожайность перспективны линии: 1-123, 119, 2-307, 2-331, 3-3-1. Линия 1-19 имеет высокое значение ОКС по средней массе кочана с компактной розеткой листьев, высокой наружной кочерыгой для механизированной уборки и оптимальной длиной внутренней кочерыги. Линия 1-123 сочетает высокое значение ОКС по сред- ней массе кочана и отрицательные значения по среднему диаметру розетки листьев и средней высоте внутренней кочерыги. Линия 2-307 имеет положительное значение ОКС по средней массе кочана в сочетании с отрицательным значением ОКС по средней длине внутренней кочерыги. Линии 2-331 и 3-3-1 в сочетании с высокими значениями ОКС по средней массе кочана имеют высокие значения ОКС по средней высоте наружной кочерыги.
Для селекции на порционный тип кочана (с массой кочана менее 2 кг) перспективными являются линии: 33-3, 11-65. Линия 3-3-3 также имеет отрицательные значения ОКС по среднему диаметру розетки листьев и средней длине внутренней кочерыги. Линия 11-65 помимо отрицательного значения ОКС по среднему диаметру розетки листьев имеет высокое положительное значение ОКС по средней высоте наружной кочерыги.
Заключение
В результате исследований оптимизирована методика получения удвоенных гаплоидов с большим выходом эмбриоидов путем модификации питательной среды. Установлена необходимость подбора рН среды для каждого генотипа инди-
Таблица 2. Оценка эффектов ОКС линий удвоенных гаплоидов капусты белокочанной
Table 2. Estimation of the effects of the general combining ability (GCA) of lines doubled haploids of cabbage
C учетом сокращения временных затрат отдельных этапов за счет камер искусственного климата схема создания чистых линий капусты белокочанной будет выглядеть следующим образом:
-
1. Посев семян и изучение исходного материала, отбор маточников, яровизация: весна-осень Х – год начала селекционной работы;
-
2. Производство линий удвоенных гаплоидов в культуре изолированных микроспор (получение, адаптация, яровизация на стадии «штеклингов»): зима-осень Х+1;
-
3. Размножений линий удвоенных гаплоидов, получение гибридных ком-
- бинаций, оценка комбинационной способности линий: зима-осень Х+2.
Таким образом, используя метод культуры изолированных микроспор in vitro , требуется 3 года для получения и оценки линий со 100% гомозиготностью, которые в дальнейшем можно включать в различные селекционные программы.
Об авторах:
Anna I. Mineykina – Ph.D. in Agriculture, Research Officer of Laboratory of Biotechnology Lyudmila L. Bondareva – Doctor of Sc. in Agriculture, Head of Laboratory of Cole Crop Breeding and Seed Production Darya V. Shumilina – PhD in Biological sciences, Senior Research Officer of Laboratory of Biotechnology Elena A. Domblides – Ph.D. in Agriculture, Head of Laboratory of Biotechnology
Alexey V. Soldatenko – Dr. of. Sc. in Agriculture
Список литературы Усовершенствование методов создания гибридов капусты белокочанной
- Пивоваров В.Ф., Старцев В.И. Капуста, её виды и разновидности (разнообразие и способы выращивания) // М.: ВНИИССОК. - 2006. - 192 с.
- Бондарева, Л.Л. Научное обоснование и разработка системы методов селекции и семеноводства капустных культур: автореф. дис.. д-ра с.-х. наук: 06.01.05 /М., 2009. - 47 с.
- Dunwell J.M. Haploids in flowering plants: origins and exploitation // J. Plant Biotech. - 2010. - Vol. 8. - P.377-424.
- Шмыкова Н.А., Шумилина Д.В., Супрунова Т.П. Получение удвоенных гаплоидов у растений рода Brassica L. // Вавиловский журнал генетики и селекции. - 2015. - Т.19. - № 1. - С. 111-120.
- Монахос С.Г. Интеграция современных биотехнологических и классических методов в селекции овощных культур: автореф. дис.. д-ра с.-х. наук: 06.01.05 / М., 2015. - 22 с.
- Бондарева Л.Л., Разин О.А. ИСПОЛЬЗОВАНИЕ КАМЕР ИСКУССТВЕННОГО КЛИМАТА ПРИ СЕЛЕКЦИИ КАПУСТЫ. Овощи России. 2014;(4):37-39. 10.18619/2072-9146-2014-4-37-39
- DOI: :10.18619/2072-9146-2014-4-37-39
- Alexander M.P. Differential staining of aborted and non-aborted pollen//Stain technol. -1969. -Vol. 44. -P. 117-122.
- Домблидес Е.А., Шмыкова Н.А., Шумилина Д.В., Заячковская Т.В., Минейкина А.И., Козарь Е.В., Ахраменко В.А., Шевченко Л.Л., Кан Л.Ю., Бондарева Л.Л., Домблидес А.С. Технология получения удвоенных гаплоидов в культуре микроспор семейства капустные (методические рекомендации)/ВНИИССОК. -М.: Изд-во ВНИИССОК. -2016. -40 с.
- Lichter R. Induction of haploid plants from isolated pollen of Brassica napus//Z. Pflanzenphysiol. -1982. -Vol. 105. -P. 427-434.
- Gamborg O.L., Miller R.A., Ojima K. Nutrients requirements of suspension cultures of soybean root cells//Exp Cell Res. -1968. -Vol. 50. -P. 151-158.
- Murashige T.A., Skoog F. Revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue cultures//Physiologia Plantarum. -1962. -V. 15. -P. 473-497.
- Шумилина Д.В., Шмыкова Н.А., Бондарева Л.Л., Супрунова Т.П. Влияние генотипа и компонентов среды на эмбриогенез в культуре микроспор капусты китайской Brassica rapa ssp. chinensis сорта Ласточка//Известия РАН. Серия биологическая. -2015. -№ 4. -368с.
- Доспехов Б.А. Методика полевого опыта/под ред. Б.А. Доспехова//М.: Агропроимздат, 1985. -350 с.
- Griffing B.A. Concept of general and specific combining ability in relation to diallel crossing systems//Australian J. Biol. Sci. -1956. -Vol. 9. -P. 463-493.
- Сапожникова Е.В., Дорофеева Л.С Определение содержания АК в окрашенных растительных экстрактах йодометрическим методом//Консервная и овощесушильная промышленность. -1966. -№ 5. -29 с.
- Квасников Б.В., Белик Т.А. Методика оценки сортов капусты на устойчивость к киле//М., ВАСХНИЛ, 1970. -16 с.
- Маслова А.А., Ушаков А.А., Старцев В.И., Бондарева Л.Л. БОЛЕЗНЕУСТОЙЧИВОСТЬ СОРТОВ КАПУСТЫ БЕЛОКОЧАННОЙ КАК ФАКТОР СНИЖЕНИЯ ФИТОСАНИТАРНЫХ РИСКОВ В ОВОЩЕВОДСТВЕ. Овощи России. 2013;(3):50-54. 10.18619/2072-9146-2013-3-50-54
- DOI: :10.18619/2072-9146-2013-3-50-54
- Lazzeri P.A., Dunwell J.M. In vitro shoot regeneration from seedling root segments of Brassica oleracea and Brassica napus cultuvars//Ann. Bol. -1984. -Vol. 54. -P. 341.
- Klimaszewska K., Keller W.A. Plant regeneration from stem cortex protoplasts of Brassica napus//Plant Cell Tissue Org Cult. -1987. -Vol. 8. -P. 225-233.
- Монахос С.Г., Нгуен М.Л., Безбожная А.В. и др. Связь плоидности с числом хлоропластов в замыкающих клетках устьиц у диплоидных и амфидиплоидных видов Brassica//С.-х. биология. -2014. -№ 5. -С.44-54.