Усовершенствование технологии адаптации и доращивания клюквы болотной (Vaccinium oxycoccos L.), полученной способом клонального микроразмножения, к условиям ex vitro

Funding: this research was conducted under a thematic plan-assignment of the Ministry of Agriculture of Russia, project number 125082209764-2 entitled “Development of New Generation Agrotechnologies for Berry Plants Using Biotechnological Methods for Establishing Berry Plantations”, funded by the federal budget in 2025.

Введение. На сегодняшний день в целях сохранения хозяйственно ценных признаков сортов и гибридов ягодных растений, в частности малораспространенных и трудноразмножаемых культур, одним из наиболее совершенных и экономически целесообразных способов получения генетически однородного и оздоровленного селекционного посадочного материала ягодных культур является метод микроклональ-ного размножения [1–4]. Клональное микроразмножение в настоящее время является единственным методом быстрого размножения элитных селекционных клонов и новых сортов куль- турных растений [5, 6]. Кроме того, методы культивирования in vitro ягодных растений рода Vaccinium также используются в криоконсервации, селекции in vitro, мутагенезе, межвидовых и интерсекционных гибридах, генетической трансформации и производстве вторичных метаболитов фармацевтической ценности в суспензионных и каллусных культурах [7–10].

В настоящее время в условиях Московского региона ведется работа по разработке технологического регламента выращивания микроклонально размноженного посадочного материала наиболее перспективных ягодных культур рода

Vaccinium , в т. ч. клюквы болотной [11]. Клюква – высокоценная пищевая коммерческая ягодная культура. Плоды клюквы являются источником полезных для здоровья питательных веществ, среди которых: пищевые волокна, антиоксиданты (витамин С, бета-каротин, фолиевая кислота, эллаговая кислота, антоцианы). Было установлено, что из группы флавонолов в образцах плодов клюквы преобладают гиперозид и мири-цетин-3-O-галактозид; из группы антоцианов – цианидин-3-O-галактозид, цианидин-3-O-араби-нозид, пеонидин-3-O-галактозид и пеонидин-3-O-арабинозид, а из группы тритерпеновых соединений – урсоловая кислота [12]. Ягоды клюквы проявляют выраженные антибактериальные и противогрибковые свойства благодаря наличию в них антоцианозидов, бензойной кислоты и других важных биологически активных соединений. Ягоды употребляются как в свежем, так и в переработанном виде – в замороженном, консервированном, а также в виде концентратов и сушеных продуктов, таких как варенье, конфеты, желе, соки, сиропы, мороженое, выпечка, мюсли, молоко и алкогольные напитки. Продукты из плодов растения находят применение в качестве пищевых добавок и для изготовления различных фармацевтических препаратов. Следует особо подчеркнуть, что этанольный экстракт плодов клюквы является перспективным природным средством для разработки на его основе медицинских препаратов для лечения бактериальных инфекций и рака [13].

Необходимо отметить, что главным ограничивающим фактором развития микроклонально размноженных растений-регенерантов при промышленном выращивании являются трудности их адаптации ex vitro, так как пересадка растений в нестерильные почвенные условия сопровождается колоссальным физиологическим стрессом, связанным с новым режимом влажности, освещенности и питания, а также высокой патогенной нагрузкой [14–17]. Сложность перевода пробирочных растений в условия культивирования ex vitro связана с некоторыми анатомическими и физиологическими особенностями ягодных растений in vitro [18, 19]. Поэтому основная задача при адаптации микроклонально размноженных растений заключается в смягчении абиотического стресса и обеспечении плавного перехода к культивированию в новых условиях среды. Важной составляющей в процессе адаптации микроклонов является также оптими- зация состава субстрата [20]. Следует особо подчеркнуть, что в нестерильных условиях микроклонально размноженные растения часто сталкиваются с проблемой водного баланса [21, 22]. Дело в том, что, попадая в нестерильные условия, микроклоны становятся чрезвычайно уязвимыми к дисбалансу поступления воды в растения на фоне увеличения транспирации.

В связи с этим в процессе адаптации микроклонов к новым условиям роста необходимо контролировать все процессы развития растений, что приведет к высокой приживаемости посадочного материала и напрямую повлияет на существенное снижение его себестоимости, показав в итоге высокий экономический эффект. Поскольку адаптация растений, размноженных in vitro к нестерильным условиям является обязательным этапом клонального микроразмножения, исследования, направленные на выявление адаптивного потенциала микроклонально размноженных растений V. oxycoccos , а также разработка и усовершенствование технологии их адаптации являются актуальными задачами ягодоводства России.

Цель исследования – провести усовершенствование технологии адаптации и доращивания микроклонов клюквы болотной ( Vaccinium oxycoccos L.) к условиям ex vitro в условиях интродукции в Московском регионе.

Задачи : определить приживаемость и морфобиометрические показатели сортовых растений V. oxycoccos (Краса Севера, Фомич), полученных методом клонального микроразмножения, при адаптации к нестерильным условиям ex vitro в зависимости от состава субстрата; приживаемость и морфобиометрические показатели микроклонально размноженных сортовых растений V. oxycoccos (сорта Краса Севера, Фомич) при доращивании в контейнерах на субстрате из верхового торфа.

Объекты и методы. Исследования проводились на базе Российского государственного аграрного универститета – МСХА им. К.А. Тимирязева в 2024–2025 гг. В качестве источников объектов исследования изучали растения клюквы болотной (V. oxycoccos) сортов российской селекции – Краса Севера и Фомич, полученные методом клонального микроразмножения по общепринятым методикам [1]. Регенерацию растений проводили на модифицированной культуральной среде Woody Plant Medium (WPM) c добавлением зеатина на этапе проли- ферации побегов («собственно микроразмножение»), индолилуксусной кислоты (ИУК) – на этапе укоренения микропобегов in vitro.

Укоренившиеся in vitro растения-регенеранты извлекали из пробирок, корни растений промывали в 1 %-ном растворе KMnO4 в течение 30 с, затем пересаживали в мини-парники для адаптации. В качестве субстратов для адаптации использовали торф верхового типа (pHKCl = 2,8–3,1; размер фракции – 20–40 мм), а также смеси торфа с речным песком (размер фракции – 0,4–0,8 мм) в соотношении 3 : 1, смеси торфа с вермикулитом в соотношении 3 : 1 (размер фракции – 0,5–2,0 мм), смеси торфа с агроперлитом (размер фракции – 1,0–5,0 мм) в соотношении 3 : 1, смеси торфа с природным вулканическим цеолитом (размер фракции – 3,0–5,0 мм) в соотношении 3 : 1. Предварительно торф пропаривали при температуре не ниже 90 °C в течение 40 мин под укрытием при влажности 80– 90 %; речной песок промывали и обжигали при температуре 180 °C в течение 2 ч. В адаптационном помещении поддерживались следующие условия: интенсивность освещения – 8000 лк с использованием светодиодных ламп OSRAM Fluora L36/77 T8 (OSRAM Licht AG, Германия) с цветовой температурой 4000 К, PPFD 165 мкмоль/м2/с, соотношение красного (650– 660 нм) и синего (440–450 нм) света 3 : 1, температура воздуха 25 °C, относительная влажность воздуха – 80–90 %. Ежедневно в течение 14 сут проводили опрыскивание растений водой (не менее 3 раз в сутки). Учет приживаемости и морфометрических показателей растений (число побегов на растении, шт.; средняя длина по- бега, см; число листьев на побеге, шт.) проводили на 10-е, 20-е и 30-е сутки адаптации растений к нестерильным условиям ex vitro. Для каждого варианта обработки (субстрата) тестировали 10 растений в 3 повторностях.

В I декаде июня 2025 г. растения пересаживали в контейнеры объемом 1 и 2 л, наполненные субстратом из верхового торфа, и доращивали в условиях закрытого грунта. В течение трех месяцев в конце каждой декады проводили учет приживаемости и морфобиометрических показателей растений (средняя длина побега, см; число побегов, шт/растение; количество листьев, шт/побег).

Статистическую обработку экспериментальных данных проводили с использованием программных средств MS Excel.

Результаты и их обсуждение . При оценке морфобиометрических показателей микрорастений V. oxycoccos , полученных методом клонального микроразмножения, установлено, что на 10-е сут адаптации к нестерильным условиям средняя длина побега растений сорта Краса Севера варьировала от 2,3 см на субстратах из смеси верхового торфа с речным песком (3 : 1) и смеси торфа с вермикулитом (3 : 1) до 2,6 см на смеси торфа с вулканическим цеолитом, тогда как на 20-е сут – от 3,4 см в варианте с использованием субстрата из смеси торфа с песком (3 : 1) до 4,4 см – торфа с агроперлитом (3 : 1). Промежуточные значения приростов отмечены на верховом торфе, смеси торфа с вермикулитом 3 : 1 и смеси торфа с цеолитом 3 : 1 (табл. 1).

Таблица 1

Приживаемость и морфобиометрические показателей растений Vaccinium oxycoccos , полученных методом клонального микроразмножения, на этапе адаптации к нестерильным условиям

Survival and morphobiometric parameters of Vaccinium oxycoccos plants obtained by clonal micropropagation at the stage of adaptation to non-sterile soil conditions

Состав субстрата	Средняя длина побега, см		Число побегов на растении, шт.		Количество листьев на побеге, шт.		Приживаемость, %
	Краса Севера	Фомич	Краса Севера	Фомич	Краса Севера	Фомич	Краса Севера	Фомич
1	2	3	4	5	6	7	8	9
10-е сут
Верховой торф	2,5±0,36	2,7±0,32	1,0±0,15	1,0±0,14	6,9±0,15	5,9±0,29	42	56

Окончание табл. 1

1	2	3	4	5	6	7	8	9
Верховой торф + речной песок 3:1	2,3±0,17	2,4±0,48	1,0±0,12	1,0±0,21	6.2±0,46	4.2±0,44	62	44
Верховой торф + агроперлит 3:1	2,3±0,23	2,5±0,46	1,0±0,17	1,0±0,19	7,1±0,23	6,8±0,25	67	69
Верховой торф + вермикулит 3:1	2,4±0,51	2,4±0,29	1,0±0,11	1,0±0,17	6,3±0,34	5,4±0,38	56	51
Верховой торф + вулканический цеолит 3:1	2,6±0,27	2,8±0,36	1,0±0,19	1,0±0,23	7,2±0,21	6,4±0,17	62	87
20-е сут
Верховой торф	3,6±0,10	3,7±0,17	2,0±0,17	2,0±0,19	13,2±0,51	14,1±0,22	39	49
Верховой торф + речной песок 3:1	3,4±0,19	3,6±0,32	2,0±0,23	2,0±0,28	12,7±0,14	13,3±0,45	54	40
Верховой торф + агроперлит 3:1	3,9±0,27	3,7±0,45	2,0±0,35	2,0±0,11	10,2±0,33	11,2±0,34	59	61
Верховой торф + вермикулит 3:1	3,7±0,44	3,6±0,23	2,0±0,31	2,0±0,10	11,2±0,21	11,2±0,27	54	49
Верховой торф + вулканический цеолит 3:1	3,8±0,37	3,9±0,31	2,0±0,47	2,0±0,29	13,7±0,41	14,2±0,29	68	72
30-е сут
Верховой торф	4,5±0,71	4,9±0,61	3,0±0,11	4,0±0,53	17,9±0,33	20,5±0,45	34	38
Верховой торф + речной песок 3:1	4,1±0,14	5,1±0,56	3,0±0,14	3,0±0,41	16,8±0,56	19,5±0,41	48	37
Верховой торф + агроперлит 3:1	4,8±0,32	5,8±0,44	3,0±0,10	3,0±0,17	17,9±0,48	18,5±0,38	51	57
Верховой торф + вермикулит 3:1	4,2±0,51	4,8±0,32	3,0±0,21	3,0±0,37	16,4±0,31	20,5±0,19	48	44
Верховой торф + вулканический цеолит 3:1	4,7±0,57	5,8±0,30	3,0±0,17	4,0±0,34	19,9±0,27	21,2±0,32	63	65

В целом за 20 дней прирост побегов V. oxycoccos сорта Краса Севера варьировал от 0,9 см на верховом торфе до 1,6 см на смеси торфа с агроперлитом. На 30-е сут адаптации отмечено, что на субстрате из смеси торфа с цеолитом (3 : 1) длина побегов увеличилась на 2,1 см (или 45 %), тогда как наименьшее изменение данного показателя (1,5 см, или 31 %) выявлено на субстрате смеси из торфа с агроперлитом (3 : 1).

При исследовании влияния состава субстрата на длину побегов растений V. oxycoccos сорта Фомич выявлена аналогичная закономерность: первые 20 сут адаптации практически на всех видах субстратов она изменилась от 1,0 до 1,2 см, что составляет около 28 %. При этом на начальном этапе адаптации к нестерильным условиям состав субстрата не оказывал существенного влияния на длину побегов у сорта Фомич. На 30-е сут адаптации максимальный прирост длины побегов отмечен на субстрате из смеси торфа и агроперлита 3 : 1 (3,3 см, или 57 %), минимальный – на верховом торфе (2,2 см, или 45 %). Таким образом, наиболее динамичное увеличение длины побегов у растений сорта Краса Севера отмечено на субстрате, состоящем из торфа и цеолита в соотношении 3 : 1, у сорта Фомич – на субстрате из торфа и агроперлита в соотношении 3 : 1.

Отмечено равномерное увеличение числа побегов на растениях V. oxycoccos сорта клюквы Краса Севера с 1 до 3 шт. (в 3 раза) на всех субстратах. Поэтому на начальных этапах адаптации состав субстрата не оказывал существенного влияния на побегообразовательную способность адаптируемых растений. У сорта Фомич число побегов изменилось с 1 до 4 шт. (в 4 раза), при этом лучшие результаты получены на субстратах, состоящих из торфа и торфа с цеолитом в соотношении 3 : 1, тогда как на остальных субстратах наблюдалось увеличение количества побегов с 1 до 3 шт. (в 3 раза).

Установлено, что на 30-е сут адаптации количество листьев на побеге у растений

V. oxycoccos сорта Краса Севера варьировало в широких пределах – от 6,3 шт. на субстрате из смеси торфа с вермикулитом 3 : 1 до 19,9 шт. на смеси торфа с вулканическим цеолитом 3 : 1. Так, при формировании и росте вновь образующихся побегов развивалось и росло количество листьев. Наиболее высокий результат получен при использовании субстрата из смеси торфа с речным песком 3 : 1 и смеси торфа с цеолитом (63 %), тогда на остальных субстратах увеличение количества листьев было несущественно ниже (60–61 %). Количество листьев на одном побеге растений V. oxycoccos сорта Фомич на 30-е сут адаптации варьировало от 4,2 шт. в варианте с использованием субстрата из смеси торфа с песком (3 : 1) до 6,8 шт. – торфа с агроперлитом (3 : 1). При этом наибольшее количество листьев на побегах (15,1–15,3 шт.) сформировалось при адаптации на субстратах из смеси торфа с вермикулитом (3 : 1) и смеси торфа с песком (3 : 1), тогда как наименьшее – при использовании смеси торфа с агроперлитом (3 : 1).

На 30-е сут адаптации отмечено, что лучше всего растения V. oxycoccos адаптировались на субстрате из смеси торфа с вулканическим цеолитом 3 : 1, где приживаемость составила 63–65 %. Несколько меньшей оказалась приживаемость растений при адаптации на субстрате, состоящем из смеси торфа с агроперлитом 3 : 1 (51– 57 %). Самый низкий показатель приживаемость регенерантов выявлен на субстрате из верхового торфа, составив 34 % для сорта Краса Севера и 38 % для сорта Фомич.

Адаптированные растения V. oxycoccos сортов Краса Севера и Фомич были пересажены в контейнеры объемом 1 и 2 л в субстрат из верхового торфа в I декаде июня. Начальная средняя длина побегов растений сорта Краса Севера в контейнерах составляла 4,9–5,1 см при среднем числе побегов 3–4 шт. и количестве листьев 18–19 шт. Средняя длина побегов растений более сильнорослого сорта Фомич после пересадки составила 5,8–6,3 см при количестве листьев на одном растении 18–21 шт. (табл. 2).

Таблица 2

Приживаемость и морфобиометрические показатели растений Vaccinium oxycoccos , полученных методом клонального микроразмножения, при доращивании в контейнерах на субстрате из верхового торфа

Survival and morphobiometric parameters of Vaccinium oxycoccos plants obtained by clonal micropropagation when grown in containers on a high-moor peat substrate

Период		Показатель	Краса Севера		Фомич
			Контейнер 1 л	Контейнер 2 л	Контейнер 1 л	Контейнер 2 л
Месяц	Декада
1	2	3	4	5	6	7
Июнь	I	Средняя длина побега, см	4,9±0,39	5,1±0,34	5,8±0,49	6,3±0,41
		Число побегов, шт/растение	3,0±0,16	4,0±0,25	4,0±0,19	5,0±0,09
		Количество листьев, шт/растение	18,5±0,35	19,4±0,33	20,7±0,34	21,6±0,30
	II	Средняя длина побега, см	5,4±0,18	6,2±0,28	6,6±0,19	7,1±0,32
		Число побегов, шт/растение	3,0±0,18	4,0±0,11	4,0±0,30	5,0±0,29
		Количество листьев, шт/растение	22,2±1,18	23,8±0,98	26,7±0,30	27,3±0,18
	III	Средняя длина побега, см	6,9±0,33	7,3±0,18	8,1±0,25	8,9±0,20
		Число побегов, шт/растение	3,0±0,13	4,0±0,29	4,0±0,21	5,0±0,27
		Количество листьев, шт/растение	25,4±1,17	26,9±0,75	30,5±0,29	31,8±0,36
Июль	I	Средняя длина побега, см	8,3±0,81	8,8±0,63	10,4±0,55	11,6±0,84
		Число побегов, шт/растение	4,0±0,07	4,0±0,78	4,0±0,67	5,0±0,54
		Количество листьев, шт/растение	27,3±1,11	28,8±0,95	33,5±0,45	34,8±0,71
	II	Средняя длина побега, см	9,8±0,92	10,1±0,47	11,9±0,51	12,6±0,92
		Число побегов, шт/растение	4,0±0,12	4,0±0,24	5,0±0,18	5,0±0,27
		Количество листьев, шт/растение	30,9±0,89	31,5±0,73	36,0±0,76	37,9±0,85
	III	Средняя длина побега, см	11,3±0,44	11,0±0,73	12,8±0,49	13,3±0,39
		Число побегов, шт/растение	5,0±0,67	5,0±0,62	6,0±0,39	6,0±0,21
		Количество листьев, шт/растение	38,4±1,01	39,6±1,04	40,2±1,02	41,8±0,91

Окончание табл. 2

1 2 3 4 5 6 7 Август I Средняя длина побега, см 12,2±0,51 12,5±0,61 13,7±0,51 13,9±0,77 Число побегов, шт/растение 5,0±0,38 5,0±0,84 6,0±0,67 6,0±0,48 Количество листьев, шт/растение 40,2±1,11 40,6±0,99 41,3±0,96 42,4±1,11 II Средняя длина побега, см 12,2±0,64 12,5±0,94 13,7±0,78 13,9±0,87 Число побегов, шт/растение 5,0±0,18 5,0±0,35 6,0±0,45 6,0±0,29 Количество листьев, шт/растение 40,3±1,01 40,8±0,79 41,6±0,96 42,8±1,03 III Средняя длина побега, см 12,2±0,31 12,5±0,28 13,7±0,49 13,9±0,91 Число побегов, шт/растение 5,0±0,23 5,0±0,37 6,0±0,46 6,0±0,67 Количество листьев, шт/растение 40,3±0,24 40,8±0,72 41,6±0,44 42,8±1,0 Приживаемость,% 97 98 98 99 и высокие морфометрические параметры адаптируемых микрорастений клюквы болотной (сортов Краса Севера и Фомич) выявлены при использовании в качестве субстратов торфа верхового типа, смеси торфа с вулканическим цеолитом 3 : 1 и смеси торфа с агроперлитом 3 : 1. Проведенные исследования по доращиванию клюквы болотной сортов Краса Севера и Фомич путем пересадки в контейнеры объемом 1–2 л показали, что через 3 месяца наблюдений отмечена высокая приживаемость изучаемых растений и к концу сезона не выявлено значимых различий в зависимости от объема горшка. Полученные результаты исследований показали высокую приживаемость растений V. oxycoccos (97–99 %) на этапе доращивания в горшках объемом 1–2 л с использованием верхового кислого торфа в качестве субстрата. Необходи-

мо также отметить, что наиболее адаптивным и наиболее стрессоустойчивым в опыте по пересадке растений в контейнеры большим объемом оказался сорт Фомич. Исходя из полученных данных, в течение вегетационного сезона размер контейнера не оказывал существенного влияния на качество посадочного материала растений клюквы болотной исследуемых российских сортов.

Разработанные элементы технологий могут быть использованы для усовершенствования технологического цикла получения и выращивания посадочного материала клюквы болотной с применением клонального микроразмножения и дальнейшей адаптации при культивировании в открытом грунте в агроклиматических условиях Нечерноземной зоны России.