Усовершенствованный метод препаративного выделения вируса оспы сливы и иммунохимический анализ белка оболочки

В препаратах потивирусов белок оболочки (БО) обычно гетерогенен по молекулярной массе из-за частичного протеолиза N-концевого домена, происходящего, как считается, в процессе препаративного выделения и хранения вирусного препарата под действием клеточных протеаз, которые высвобождаются при гомогенизации растительных тканей и контаминируют очищенный препарат. Неупорядоченный N-домен БО вируса оспы сливы ( Plum pox virus, PPV) длиной около 100 аминокислот экспонирован на поверхности вирусной частицы. Он содержит вирус- и штамм-специфичные эпитопы и является самой изменчивой частью молекулы БО. Деградация иммунодоминантного N-терминального домена затрудняет получение вирус-специфических антисывороток и штамм-специфических моноклональных антител и иммунохимический анализ вирусных изолятов. PPV считается самым вредоносным вирусным патогеном косточковых культур. Иммунохимические методы играют важнейшую роль в его диагностике, идентификации штамма, работе по получению устойчивых сортов, а также в эпидемиологических исследованиях и разработке превентивных мер по ограничению распространения этого вируса в насаждениях косточковых культур. Анализ БО PPV методами электрофореза в полиакриламидном геле, иммуноэлектронной микроскопии и вестерн-блота с моноклональными антителами 5В и 4DG5 соответственно к универсальному и PPV-D-специфичному эпитопам показал, что в очищенном вирусном препарате содержатся три типа субъединиц: полноразмерный БО и продукты частичного протеолиза БО с молекулярной массой 31 и 28 кДа. Три зоны БО PPV с аналогичной или близкой молекулярной массой регулярно выявлялись также при анализе экстрактов из свежих зараженных листьев табака Nicotiana benthamiana и ряда косточковых культур (персика, сливы и алычи), гомогенизированных непосредственно в буфере для нанесения образца, методом вестерн-блота с антителами к универсальному эпитопу. Эти результаты позволяют предположить, что протеолиз БО может происходить уже в зараженных клетках. Нами разработан усовершенствованный протокол препаративного выделения PPV, основанный на сочетании двух оригинальных методик (H.J. van Oosten, 1972; S. Lain с соавт., 1988). Процедура включает накопление вируса в растениях табака Nicotiana benthamiana, его экстракцию из зараженных листьев нейтральным HEPES-буфером, инкубацию экстракта, осветленного низкоскоростным центрифугированием, с 5 % Тритоном Х-100, ультрацентрифугирование на 20 % сахарозной подушке и очистку вируса посредством ультрацентрифугирования в градиенте концентрации сахарозы (10-40 %) в 0,1 М натрий-боратном буфере (рН 8,2). Метод обеспечивает выход очищенного вируса до 10 мг из 100 г свежих листьев. Вирусные частицы содержат преимущественно полноразмерный БО. Высокий выход обусловлен, по-видимому, эффективной экстракцией вируса с помощью HEPES-буфера, а также отсутствием потерь после осветления экстракта, его обработки Тритоном Х-100 и ультрацентрифугирования на сахарозной подушке. Применение Тритона Х-100 в указанной концентрации приводит к более полному отделению вируса от мембранных комплексов и солюбилизации агрегатов вирусных частиц, что повышает выход вируса. Использование таких вирусных препаратов для иммунизации животных может способствовать получению высокоспецифичных антисывороток и моноклональных антител для диагностики и иммунохимического анализа PPV