Увеличение ДНК-связывающей активности ТАТА-связывающего белка в экстрактах ядер перевиваемых опухолей печени и легкого мышей

Цель работы. Изучение ТАТА-связывающей способности ТВР, входящего в состав белков ядерных экстрактов перевиваемых опухолей печени и легких мышей линий А/Sn и С57BL/6 соответственно.

Материал и методы. В работе использовали перевиваемую гепатокарциному НA-1 и аденокарциному легких Lewis, полученные из банка опухолевых штаммов Института цитологии и генетики СО РАН. Опухоли поддерживали соответственно на мышах линий А/Sn и С57BL/6 в солидной форме, перевивая в мышцы бедра 1 раз в 2 нед. Для получения ядерных экстрактов использовали периферическую часть опухолевых узлов только что умерщвленных декапитацией животных (2–4 особи). В качестве контрольных органов использовали печень и легкие интактных животных соответствующих линий.

Выделение ядерных экстрактов, получение меченых олигонуклеотидов, анализ связывания белков с радиоактивно меченым олигонуклеотидом (EMSA) проводили по стандартным методикам с использованием «забивочной» ДНК. Олигодезоксирибонуклеотиды, идентич- ные ТАТА-содержащему участку промотора AdML длиной 26 пар нуклеотидов – 5’-tga agg ggg gcTATAAAAggg ggtgc-3’ (ТАТА-ОН), и контрольный олигонуклеотид с нарушенным ТАТА-боксом – 5’-tga agg tgg gcTGCTAGCgct ggt gg-3’ метили радиоактивным фосфором с помощью Т4 полинуклеотидкиназы. Образующиеся комплексы анализировали с помощью метода «торможения» ДНК в геле.

Результаты изучения взаимодействия белков ядерных экстрактов исследуемых опухолей и соответствующих нормальных тканей мышей с 32Р-ТАТА-ОН показали, что во всех случаях образуется один тип комплексов, которому соответствует одна полоса задержки в геле, причем с белками гепатокарциномы и аденокарциномы легких образуется на 25 % и 60 % соответственно комплексов больше, чем с белками ядерных экстрактов тканей контрольных животных. Следует отметить, что при образовании комплексов наблюдается зависимость их количества от концентрации белка, что свидетельствует о специфичности образуемых комплексов. Результаты вытеснения 32Р-ТАТА-ОН «холодным» ТАТА-ОН из комплексов с белком показали, что 32Р-ТАТА-ОН полностью вытесняется из комплексов уже при 25-кратном молярном избытке «холодного» олигонуклеотида. Это также свидетельствует о специфическом характере образуемых комплексов с 32Р-ТАТА-ОН и отсутствии неспецифической компоненты во взаимодействии. Таким образом, все полученные результаты свидетельствуют в пользу того, что с 32Р-ТАТА-ОН взаимодействует только ТВР. Дополнительным свидетельством в пользу этого является также небольшое связывание ТВР с олигонуклеотидом, у которого нарушен ТАТА-бокс. Как известно, ТВР имеет невысокое неспецифическое сродство к ТАТА-несодержа-щей ДНК.

Выводы. Таким образом, полученные в работе данные свидетельствуют об увеличении ТАТА-связывающей активности ТВР и, соответственно, об изменениях в транскрипционном аппарате опухолей НА-1 и LLC мышей. Дальнейшие эксперименты будут направлены на изучение молекулярных взаимодействий ТВР и выяснение пускового механизма увеличения его количества.