Валидация панели SNP-маркеров для контроля происхождения локальных российских пород овец

Генетическое совершенствование пород сельскохозяйственных животных основано на оценке и отборе индивидуумов, обладающих наибольшей племенной ценностью (estimated breeding value, EBV) по селекционно значимым признакам. Достоверность EBV непосредственно связана с точностью записей родословных, поэтому ошибки в идентификации родителей приводят к снижению генетического прогресса и, как следствие, к экономическим потерям (1). Информация о родословной необходима для контроля степени инбридинга — одного из важных элементов системы управления генетическими ресурсами животных (2).

Микросателлиты были открыты в 1984 году и известны также под названием коротких тандемных повторов (STR, short tandem repeats), или коротких повторов последовательностей (SSR, short sequence repeats) (3). Благодаря высокой степени полиморфизма, менделевскому типу наследования и равномерному распределению по всему геному они более 25 лет оставались наиболее широко используемым типом ДНК-маркеров для контроля происхождения сельскохозяйственных животных разных видов (4-8).

Развитие высокопроизводительных методов анализа генома привело к созданию и использованию панелей на основе полиморфизмов единичных нуклеотидов (single nucleotide polymorphism, SNP) при идентификации происхождения животных (9-13). Хотя SNP-маркеры менее полиморфны по сравнению с STR (большинство SNP биаллельны), этот недостаток полностью нивелируется благодаря возможности проводить одновременный анализ нескольких десятков и даже сотен SNP с относительно небольшими затратами. Преимущества анализа SNP состоят в отсутствии особых требований к качеству ДНК (анализ SNP проводится, как правило, посредством получения коротких ампликонов длиной менее 100 п.н.), автоматизации процесса генотипирования, легкости в интерпретации результатов, возможности прямого сопоставления данных между лабораториями.

Обеспечение высокой достоверности контроля происхождения животных на основе SNP требует использования большего числа локусов по сравнению с STR. В исследованиях, проведенных на человеке (14, 15), свиньях (16), мясном и молочном крупном рогатом скоте (17, 18), было показано, что для достижения сходной информативности на 1 STR требуется 3-6 SNP. При этом авторы указывают, что повышение информативности SNP панелей может достигаться за счет увеличения числа исследуемых полиморфизмов и приближения средней частоты минорных аллелей (minor allele frequency, MAF) к 0,5. По данным K.G. Dodds с соавт. (19), для достижения информативности, аналогичной таковой у широко используемых панелей на основе STR, необходимо в 3-4 раза больше SNP, в то время как в случае панелей на основе доминантных маркеров (например, ISSR и AFLP) последних должно быть в 17 раз больше.

Среди подходов, используемых для определения происхождения индивидуумов на основе ДНК (простое исключение, распределение по категориям и фракциям, реконструкция генотипа) (20, 21), наиболее распространен метод исключения родителей. Он основан на принципе, согласно которому у потомков в каждом локусе должны быть только аллели, имеющиеся у родителей, и вероятность исключения (probability of exclusion, PE) — это вероятность того, что заявленный индивид исключается в качестве родителя (22). Этот метод требует высокой точности генотипирования (> 99 %) и значений MAF ≥ 0,3. Ключевым фактором, определяющим эффективность систем контроля происхождения, служит выбор SNP.

Разработка панелей SNP маркеров для анализа происхождения овец была начата после создания Международным консорциумом по геномике овец (International Sheep Genomics Consortium, ISGС) чипа средней плотности Ovine SNP50K BeadChip, включающего 54241 SNP (23). В настоящее время для овец создано шесть панелей, различающихся набором и числом SNP. Консорциумом ISG предложена панель, включающая 88 SNP (24), содружеством CSIRO (Australia’s Commonwealth Scientific and Industrial Research Organization, Австралия) и Центром SheepCRC (Sheep Cooperative Research Centre, Австралия) — 382 SNP (25), научно-исследовательским институтом AgResearch (Новая Зеландия) — 84 и 300 SNP (12). M.P. Heaton с соавт. (13) разработали панель SNP для оценки глобального разнообразия пород, включающую 163 SNP, и выделили среди них набор из 109 SNP для использования на североамериканских породах овец.

В качестве официальной панели для тестирования происхождения домашних овец Международным обществом генетики животных (ISAG, International Society for Animal Genetics) рекомендованы 88 аутосомных маркеров, предложенные Консорциумом ISG и дополненные одним Y-хромосомным SNP (26). Выбор SNP для включения в панель осуществлялся по результатам тестирования 22 пород овец из Африки, Азии и Европы с использованием технологии Golden Gate (10). Отобранные SNP были оценены на расширенной выборке из 74 пород с использованием технологии Infinium (23). В последующем была показана возможность анализа этой панели с помощью технологий Fluidigm и Sequenom (27).

Следует отметить, что вышеназванные SNP панели контроля происхождения не были протестированы на российских породах овец. Среди 74 пород, используемых для оценки информативности официальной панели ISAG, присутствовали овцы североамериканской популяции российской аборигенной романовской породы. Однако ограниченность выборки и отсутствие ясности в ее происхождении не позволяют говорить о представительности породы в целом.

Целью нашей работы стала оценка информативности панели ISAG из 88 аутосомных маркеров, принятой в качестве официальной панели для тестирования происхождения домашних овец, при контроле происхождения российских локальных пород.

Методика. Исследуемая выборка была представлена четырьмя локальными российскими породами овец — романовской (ROM, n = 22), забайкальской тонкорунной (ZBL, n = 7), аборигенной полугрубошерст-ной бурятской овцой Буубей (BUB, n = 15) и тувинской короткожирнохвостой (TUV, n = 16).

Геномную ДНК выделяли с помощью колонок Nexttec («Nexttec™ Biotechnologie GmbH», Германия) в соответствии с рекомендациями производителя. Скрининг SNP выполняли с использованием чипа Ovine SNP50K BeadChip («Illumina Inc.», CША). Обработку полученных данных проводили как для общего числа прогенотипированных маркеров (54241 SNP), так и для 88 аутосомных SNP, рекомендованных ISAG для подтверждения происхождения домашних овец (далее панель ISAG, или панель происхождения). Пороговым критерием для определения аллеля в качестве информативного было выбрано значение MAF ≥ 0,3.

Контроль качества SNP и статистический анализ полученных данных, в том числе определение MAF, расчет индекса фиксации F_st при парном сравнении по B.S. Weir с соавт. (28) и анализ главных компонент (principal component analysis, PCA) осуществляли в программе Plink 1.07 (29) . Для анализа отбирали SNP, локализованные на аутосомных хромосомах и прошедшие контроль качества по следующим параметрам: по показателю GenCall, указывающему достоверность результатов генотипирования (GC > 0,5), частоте минорных аллелей (MAF > 0,01), тесту на равновесие Харди-Вайнберга (HWE > 1e^-6) и уровню генотипирования (GENO > 0,01).

Визуализацию данных, в том числе построение PCA плотов и графиков распределения SNP-маркеров по группам в зависимости от MAF, осуществляли с помощью языка программирования R (30).

Вероятность совпадения генотипов (probability of identity, PI) для каждого локуса рассчитывали, используя формулу (31):

PI = 2 ½ ( ∑ p i ²)² - ∑ p i ⁴, где p i — частота i - го аллеля в локусе.

Значения PI для числа несцепленных маркеров k определяли как произведение индивидуальных PI каждого маркера.

Вероятность исключения (probability of exclusion, PE) для каждого локуса определяли для трех частных случаев.

• 1.    Исключение одного родителя, если известны генотипы обоих родителей и потомка (P1) (32):

• 2.    Исключение родителя, если известны генотипы одного родителя и потомка (P2) (33):

• 3.    Исключение обоих родителей, если известны генотипы родителей и потомка (P3) (33):

P1 = 1 - 2 ½ ∑ p i ²+ ∑ p i ³+ 2 ½ ∑ p i ⁴ - 3 ½ ∑ p i ⁵ - 2 ½ ( ∑ p i ²)²+ 3 ½ ∑ p i ²½ ∑ p i ³.

P2 = 1 - 4 ½ ∑ p i ²+ 2 ½ ( ∑ p i ²)²+ 4 ½ ∑ p i ³ - 3 ½ ∑ p i ⁴.

P3 = 1 + 4 ½ ∑ p i ⁴ - 4 ½ ∑ p i ⁵ - 3 ½ ∑ p i ⁶ - 8 ½ ( ∑ p i ²)²+ 8 ½ ( ∑ p i ²) ½ ( ∑ p i ³) + 2 ½ ( ∑ p i ³)².

Значения P1, P2, P3 (P) для k -го числа несцепленных маркеров определяли по формуле:

P = 1 - (1 - P 1 ) ½ (1 - P 2 ) ½ (1 - P 3 )…½ (1 - P k ).

Для расчетов PI, P1, P2 и P3 использовали программное обеспечение GenAlEx 6.5 (34).

Результаты. Результативность полногеномного SNP генотипирования (call rate) варьировала между породами от 91,5 % (BUB и TUV) до 91,8 % (ROM) и 91,9 % (ZBL) и для всей выборки овец составила 91,7 %. Все исследованные животные прошли контроль на соответствие критерию animal call rate ≥ 90 %. Поскольку исследования предусматривали анализ только аутосомных маркеров, из него были исключены 1828 SNP, локализованных на половых хромосомах. Не прошли контроль по критериям качества чтения (GC Score ≥ 0,5) и степени кластеризации (GC Score ≥ 0,3) 1371, 1469, 1665 и 1636 SNP соответственно у ROM, ZBL, BUB и TUV. Затем у исследованных пород были исключены соответственно 3479, 3663, 3743 и 3786 полиморфизмов как не соответствующие критерию SNP call rate >  90 %. Все оставшиеся маркеры удовлетворяли критерию х ² на равновесие в популяции по Харди-Вайнбергу, и для дальнейшего анализа были отобраны 47563 (87,7 %) SNP у ROM, 47281 (87,2 %) у ZBL, 47005 (86,7 %) у BUB и 46991 (86,6 %) у TUV. Для анализа всей выборки отобрали 47385 полиморфизмов (87,4 % от числа исследованных).

При оценке результатов генотипирования SNP, включенных в панель ISAG, контроль качества (SNP call rate = 99,2 %) прошли 87 из 88 локусов, за исключением DU426312_454.1, который был успешно ге-нотипирован только у 55 % животных. Однако для того, чтобы иметь данные, сопоставимые с полученными в других исследованиях, этот SNP включили в дальнейший анализ.

В исследованной выборке овец большая часть маркеров происхождения (81,8 % SNP) оказались информативными (MAF ≥ 0,3). Так, 51,1 и 30,7 % SNP встречались в диапазоне частот соответственно от 0,4 до 0,5 и от 0,3 до 0,4. Низкоинформативными были 1,1 % SNP, встречающихся с частотой от 0 до 0,1 %. Распределение всех исследованных SNP по груп- пам в зависимости от MAF было более равномерным: для MAF > 0,0-< 0,1; ≥ 0,1-< 0,2; ≥ 0,2-< 0,3; ≥ 0,3-< 0,4 и ≥ 0,4-≤ 0,5 доли SNP составили соответственно 9,2; 17,8; 21,2; 24,6 и 26,2 %.

Рис. 1. Распределение исследованных SNP (single nucleotide polymorphism) у овец пород романовская (А) , забайкальская тонкорунная (Б) , Буубей (В) и тувинская короткожирнохвостая (Г) в зависимости от средней частоты минорных аллелей (minor allele frequency, MAF): 1 — > 0,0-< 0,1, 2 — ≥ 0,1-< 0,2, 3 — ≥ 0,2-< 0,3, 4 — ≥ 0,3-< 0,4, 5 — ≥ 0,4- ≤ 0,5; а — 88 SNP, включенных в панель ISAG (International Sheep Genomics Consortium), б — 47385 SNP, отобранных по результатам контроля качества для пород.

Доля информативных SNP различалась между породами и составляла 56,8 % у ROM, 63,4 % — у ZBL, 71,6 % — у BUB и 72,7 % — y TUV (рис. 1). Полиморфизмы с MAF < 0,1 встречались во всех исследованных породах, причем наибольший процент малоинформативных маркеров отмечался у ZBL и BUB (по 4,5 %), а наименьший — у ROM (1,1 %). Этот факт, возможно, объясняется тем, что среди животных, участвовавших в тестировании панели происхождения (13, 26), были 10 овец романовской породы. Однако эти овцы были представлены только североамериканской популяцией, которая не может характеризовать породу в целом. У овец TUV 2,3 % маркеров имели MAF < 0,1, при этом маркер DU196132_525.1 был мономорфным.

Средние значения MAF составили для ROM — 0,332±0,110, для ZBL — 0,335±0,118, для BUB — 0,347±0,121 и для TUV — 0,360±0,109, в целом по выборке — 0,380±0,091. При использовании полногеномной панели средние значения MAF для ROM, ZBL, BUB и TUV равнялись соответственно 0,261±0,146; 0,272±0,146; 0,269±0,143 и 0,272±0,142, для всей выборки — 0,292±0,131.

Из 88 маркеров происхождения для 21 SNP (23,9 %) отмечали высокую информативность во всех четырех породах (MAF ≥ 0,3); 37 (42,0 %), 17 (19,3 %) и 10 SNP (11,4 %) оказались информативными соответственно в трех, двух и только в одной породе. Три SNP были неинформативны для всех четырех пород (табл. 1).

1. SNP (single nucleotide polymorphism) происхождения и среднеарифметические значения MAF (minor allele frequency) для четырех локальных российских пород

SNP		Хромосома	MAF
			ROM	ZBL	BUB	TUV	все породы*
SNP-маркеры для четырех				локальных пород		о в е ц (MAF < 0,3)
DU232924	365.1	1-я	0,068	0,071	0,067	0,156	0,092
DU501115	497.1	2-я	0,182	0,143	0,200	0,094	0,158
DU372582	268.1	9-я	0,159	0,071	0,067	0,188	0,133
	SNP-маркеры		для трех локальных		п о р од ов ец (MAF < 0,3)
DU305004	417.1	4-я	0,250	0,125	0,393i	0,156	0,242
DU453259	440.1	5-я	0,114	0,125	0,231	0,344i	0,203
DU530067	219.1	7-я	0,114	0,375i	0,250	0,125	0,183
DU213735	493.1	8-я	0,318i	0,250	0,286	0,250	0,417
DU417675	79.1	11-я	0,386i	0,250	0,179	0,219	0,358
DU275428	276.1	13-я	0,273	0,438i	0,286	0,250	0,292
DU223894	556.1	14-я	0,364i	0,250	0,286	0,281	0,408
DU264531	279.1	19-я	0,273	0,438i	0,286	0,281	0,317
DU258053	237.1	19-я	0,295	0,563i	0,250	0,219	0,300
DU380983	440.1	21-я	0,250	0,188	0,036	0,406i	0,233

П р и м еч а ни е. ROM — романовская порода, ZBL — забайкальская тонкорунная порода, BUB — Буу-бей, TUV — тувинская короткожирнохвостая порода. Индексом «i» обозначены информативные SNP, ос- тальные SNP— неинформативные.

* Для MAF представлено не среднеарифметическое значение, а величина, рассчитанная при объединении всех четырех пород в один пул.

Сравнительный анализ PCA плотов, построенных по результатам исследований 47385 SNP и 88 SNP (рис. 2), показал довольно четкую дифференциацию пород при применении всего спектра маркеров, в то время как при использовании панели происхождения формировались мало консолидированные частично перекрывающиеся массивы. Анализ значений Fst при парном сравнении как меры генетических различий (табл. 2) ожидаемо подтвердил снижение степени дифференциации при использовании панели происхождения по сравнению с полногеномными SNP-профилями при сохранении характера выявленных генетических связей между породами (r2 = 0,95). Следовательно, полученные данные хоть и подтверждают сохранение породной зависимости SNP панели ISAG, в целом указывают на ее относительно высокую универсальность.

Рис. 2. Анализ главных компонент, выполненный на основе SNP (single nucleotide polymorphism) у овец пород романовская ( • ) , забайкальская тонкорунная ( о ) , Буубей (А) и тувинская короткожирнохвостая ( А) : А — PCA плот по 47385 детектируемым OvineSNP50K BeadChip маркерам, Б — PCA (principal component analysis) плот по 88 маркерам, включенным в панель ISAG (International Sheep Genomics Consortium).

Расчет вероятности совпадения генотипов (PI) по 88 SNP показал высокую информативность панели: для ROM, ZBL, BUB и TUV значения PI составили соответственно 5,86½10-33, 5,24½10-33, 7,48½10-33 и 4,32½10-33.

Вероятность исключения в качестве родителя P1 оказалась ≥ 99,99 % для всех четырех пород. Значение P2 было максимальным для TUV (P2 ≥ 99,99 %), для трех остальных пород — P2 ≥ 99,98 %. Значение P3 для всех пород было ≥ 99,99 %.

2. Индекс фиксации Fst при парном сравнении для SNP панели происхождения и полногеномных SNP-профилей у сравниваемых пород

Порода	1 ROM 1	ZBL 1	BUB 1	TUV
ROM		0,0544	0,0578	0,0493
ZBL	0,0797		0,0437	0,0418
BUB	0,0834	0,0537		0,0261
TUV	0,0820	0,0542	0,0318

П р и м еч а ни е. Над диагональю представлены значения, рассчитанные на основании данных анализа 88 SNP (single nucleotide polymorphism) маркеров, включенных в панель ISAG (International Sheep Genomics Consortium); под диагональю — значения, рассчитанные по 47385 SNP маркерам, отобранным по результатам контроля качества для пород.

Создание панелей для контроля происхождения овец на основании наиболее высокоинформативных SNP — актуальная проблема овцеводства. Так, M.P. Heaton с соавт. (13) с этой целью использовали 2915 овец 74 породных групп, предоставленных консорциумом ISG, выполнили анализ 47693 аутосомных SNP с помощью множественных критериев и выбрали 163 SNP с желательными свойствами для тестирования происхождения. В среднем каждый из отобранных SNP оказался высокоинформативным (MAF ≥ 0,3) в 48±5 породных группах. Для создания панели контроля происхождения североамериканских пород овец из 163 SNP были выбраны 109. Результативность сканирования и точность для этих 109 SNP составила более 99 %.

Число требующихся SNP зависит от MAF и используемой маркерной панели. Посредством математического моделирования E. Baruch и J.I. Weller (35) установили, что для достижения вероятности исключения, равной 99 %, нужно от 15 до 54 SNP. Число необходимых SNP возрастает при ограничении количества информации (если известен генотип только одного вероятного родителя) и значении MAF < 0,1. При тестировании на российских породах международной панели происхождения, в состав которой входят 88 аутосомных маркеров, доля высокоинформативных SNP в среднем по всей выборке составила 82 %. Необходимо отметить, что такое значение складывается не только из отдельных SNP, высокоинформативных во всех породах, но и за счет маркеров, информативных в двух или трех породах, на что указывают различия для MAF ≥ 0,3 между породами — от 50,0 до 61,4 %.

Согласно J.W. Kijas с соавт. (27), отбор SNP для создания панели происхождения должен быть проведен со смещением в сторону высоких значений MAF (0,3-0,5) с целью ее унификации, то есть обеспечения возможности использовать панель на широком спектре пород. Наши исследования в целом подтвердили это правило и для российских локальных пород: 56,8; 63,4; 71,6 и 72,7 % животных пород ROM, ZBL, BUB и TUV характеризовались значениями MAF, большими или равными пороговому значению 0,3.

Одним из критериев информативности панели служит определение числа SNP, требующихся для получения высокой вероятности исключения родителей. Нами показано, что при наличии данных о генотипах обоих родителей минимальное число маркеров, необходимое для их исключения в качестве родителей с вероятностью более 99,99 % (критерий P3), для каждой из исследованных пород составляло 27. Для достижения аналогичной вероятности исключения одного из родителей при наличии информации об обоих (P1), требовалось не менее 43 SNP. Если генотип одного из родителей был неизвестен (Р2), минимальное необходимое число маркеров возрастало до 66.

Таким образом, основываясь на множестве критериев, в том числе на вероятности совпадения генотипов и вероятности исключения в качестве родителя (родителей), можно сделать вывод, что международная панель ISAG (International Sheep Genomics Consortium), включающая 88 аутосомных маркеров, может быть использована для контроля достоверности происхождения четырех российских локальных пород (романовской, забайкальской тонкорунной, Буубей и тувинской короткожирнохвостой). Для создания наиболее информативной панели с целью оценки происхождения всего спектра пород, разводимых в России, и их роли в обеспечении глобального биоразнообразия домашних овец в дальнейшем следует ориентироваться на увеличение числа исследованных пород, а также на анализ других SNP панелей, предложенных научным сообществом.

Л И Т Е Р А Т У Р А

Sel’skokhozyaistvennaya biologiya [ Agricultural Biology ], 2015, V. 50, ¹ 6, pp. 746-755

VALIDATION OF THE SNP PANEL FOR PARENTAGE ASSIGNMENT IN LOCAL RUSSIAN SHEEP BREEDS

Acknowledgements:

The equipment of Bioresources and Bioengineering Center of L.K. Ernst All-Russian Research Institute of Animal Husbandry was used.

Supported by the Russian Science Foundation, project ¹ 14-36-00039