Вариабельность экспрессии гена остеопонтина при влиянии различных факторов остеогенеза и их комбинаций

Актуальность. Процесс, который инициирует и регулирует минерализацию, до конца ещё не понят. К настоящему времени сформировалось множество теорий, в основе которых лежат биофизические и биохимические феномены. Однако достоверно известно, что предпосылкой является секреция и организация межклеточно- го матрикса. Согласно одной теории, в инициации минерализации критическую роль играют так называемые матричные пузырьки, согласно другой, минерализация всецело зависит от фибриллярных компонентов матрикса, прежде всего коллагена I типа, который ассоциирован с некоторыми представителями неколлагеновой фракции белков. Коллаген I типа рассматривается как мажорный компонент, составляющий, по разным оценкам, от 60–70 до 90 % всех костных белков. Коллаген формирует белковую основу архитектуры кости и образует остов, на который откладывается минеральная фаза. Помимо коллагена I типа, присущего костной ткани, потенциальная роль в минерализации отводится трём представителям неколлагеновой фракции белков, ассоциированных с коллагеновыми фибриллами – это остеопонтин, остеокальцин и остеонектин. Остеопонтин – RGD-содержащий кислый фосфопротеин. По некоторым данным, он обладает двумя сайтами связывания кальция – сайтом связывания гидроксиапатита и сайтом связывания собственно кальция. Согласно данным некоторых исследователей, возможности связывания кальция и гидроксиапатита остеопонтином зависят от его количества и, при определённых условиях, белок может оказывать ингибирующее действие. Существуют чёткие экспериментальные данные относительно влияния аскорбиновой кислоты на синтез коллагена I типа, активность щелочной фосфатазы, накопление остеокальцина и минерализацию матрикса. При культивировании в среде с глицерофосфатом показано, в некоторых аспектах, аналогичное действие. Являясь субстратом щелочной фосфатазы, глицерофосфат приводит к усилению её экспрессии. К смежному эффекту приводит культивирование клеток в среде, содержащей комбинацию факторов. Дексаметазон стимулирует дифференцировку мезенхимных клеток в остеокласты, маркером которого остео-понтин не является.

Цель исследования. Сравнение влияния аскорбиновой кислоты, β-глицерофосфата, дексаметазона и их комбинаций на экспрессию гена остеопонтина в культуре мезенхимных клеток костного мозга.

Материал и методы. Материалом для исследования явились культуры мезенхимных клеток костного мозга, полученные от мышей линии CBA/j57 и индуцированные к остеогенной дифференцировке аскорбиновой кислотой, β-глицерофосфатом, дексаметазоном и их комбинациями, масса мышей была 18–20 г, возраст 6–8 нед. В качестве контроля использовали нуль-культуру. Экспрессию гена остеопонтина оценивали методом обратно-транскриптазной полимеразной цепной реакции с использованием коммерческих наборов РЕВЕРТА (Ампли-Сенс, Россия). Результаты оценивались методом электрофореза продуктов амплификации в 2,5 % агарозном геле с помощью программы Phoretix 1D.

Результаты. В процессе анализа получили следующие данные: в контрольной (нуль-культуре) клеток экспрессия гена остеопонтина составила 4,75 % по отношению к GAPDH; в культуре, где использовался β-глицерофосфат – 17,58 %, аскорбиновая кислота – 13,44 %. В среде с дексаметазоном показана экспрессия на самом низком уровне – 7,98 %. Из вариантов, где использовались комбинации факторов, наиболее низкий уровень экспрессии показали варианты с комбинацией глицерофосфата и дексаметазона – 10,27 %, при этом комбинация глицерофосфата и аскорбиновой кислоты показала практически вдвое превышающий результат – 20,30 %.

Выводы. Различные факторы остеогенеза и их комбинации по-разному влияют на экспрессию гена остеопонтина. Максимальной эффективностью обладает сочетание β-глицерофосфата и аскорбиновой кислоты (20,30 %), минимальный уровень экспрессии был показан для контрольной культуры и дексаметазона (4,75 % и 7,98 % по отношению к GAPDH соответственно).