Вариабельность митохондриального генома у больных раком молочной железы в популяции якуток

Автор: Тихонов Д.Г., Егоров А.Н., Голубенко М.В., Молоков А.Ю., Белявская В.А., Гервас П.А., Скрябин Н.А.

Журнал: Сибирский онкологический журнал @siboncoj

Рубрика: Лабораторные и экспериментальные исследования

Статья в выпуске: 6 т.22, 2023 года.

Бесплатный доступ

Введение. Популяция саха (якуты) - коренное население Сибири, проживающее на территории якутии, отличается одним из самых низких в мире уровнем заболеваемости раком молочной железы (РМЖ). Низкий уровень заболеваемости РМЖ коренного населения якутии отмечен в ряде публикаций, но до настоящего времени причины этого явления не до конца выяснены. Следует отметить, что изучение факторов, снижающих риск заболевания РМЖ, имеет важное значение для его профилактики. По результатам ряда исследований, у якутов не обнаружено наследственных форм РМЖ, не найдено патогенных вариантов генов BRCA1/2 , ассоциированных с наследственными синдромами РМЖ и рака яичника (Ря). в связи с этим мы приняли решение сместить акцент на исследование митохондриального генома больных РМЖ саха методом секвенирования. Цель исследования - выявить варианты митохондриального генома, ассоциированные с РМЖ, у пациенток саха. Материал и методы. в исследование включено 14 пациенток саха с диагнозом РМЖ, средний возраст составил 49 лет. вы-деление дНК осуществляли методом фенол-хлороформной экстракции. дНК-библиотеки готовили с помощью набора Nextera Flex (Illumina, США). Полногеномное секвенирование митохондриального генома выполнялось на приборе MiSeq (Illumina, США) на базе ЦКП Томского НИМЦ. Полученные результаты у больных РМЖ сравнивались с популяционным контролем.

Еще

Рак молочной железы, этническая популяция саха, варианты митохондриальной днк, прогнозирование патогенности

Короткий адрес: https://sciup.org/140303562

IDR: 140303562 | DOI: 10.21294/1814-4861-2023-22-6-74-82

Текст научной статьи Вариабельность митохондриального генома у больных раком молочной железы в популяции якуток

Якуты (самоназвание саха) – коренное население Сибири с очень низким уровнем заболеваемости РМЖ [1–3]. Стандартизованные по возрасту показатели заболеваемости РМЖ коренного женского населения Республики Саха (Якутия) составляют 17,68 на 100 000 населения, что ниже показателей других сибирских этносов

(Республика Бурятия – 26,63; Республика Тыва – 24,02; Республика Алтай – 26,31) и ниже, чем в других регионах РФ (Центральный федеральный округ – 28,10; Северо-Западный федеральный округ – 29,09) [4].

В литературе нет информации о патогенных мутациях генов BRCA1/2, ассоциированных с РМЖ в популяции саха. Известно, что мутации генов

BRCA этноспецифичны, есть сведения об отсутствии часто встречаемых мутаций генов BRCA1/2 в популяции саха, а в работе П.А. Гервас и соавт. сообщается о новой мутации гена PALB2 у молодой пациентки саха с РМЖ с отягощенным онкологическим анамнезом [5–6]. В литературе нами найдена информация об исследованиях по поиску каузативных мутаций при РМЖ в популяции саха методом ПЦР в режиме реального времени с применением метода таргетного высокопроизводительного секвенирования, при этом патогенных мутаций не выявлено. В связи с этим мы приняли решение исследовать митохондриальный геном больных РМЖ саха методом секвенирования. Так, в литературе описаны наследуемые заболевания в результате повреждений мтДНК, такие как оптическая нейропатия Лебера, синдром MELAS (Mitochondrial encephalomyopathy, lactic acidosis, and stroke-like episodes), синдром MERRF (Myoclonic Epilepsy with Ragged Red Fibers), синдром MIDD (maternally inherited diabetes and deafness), а также злокачественные новообразования [7]. Нами впервые определены варианты митохондриального генома у представительниц якутского этноса, больных раком молочной железы.

Цель исследования – выявить варианты митохондриального генома, ассоциированные с РМЖ, у пациенток этнической группы саха.

Материал и методы

В исследование включено 73 пациентки с диагнозом РМЖ/РЯ, в возрасте от 22 до 79 лет (средний возраст – 49 лет), принадлежащих к якутской этнической группе. Диагноз был морфологически верифицирован. Пациентки подписали информированное согласие на участие в данном исследовании и были протестированы на наличие частых мутаций генов BRCA1/2. Далее из 73 больных отобрано 22 пациентки с учетом отягощенного семейного анамнеза. Материал 22 пациенток протестирован на наличие патогенных мутаций 27 генов, ассоциированных с онкологическим синдромами (данные не представлены). Далее с учетом данных таргетного секвенирования и требований к материалу отобрано 14 образцов мтДНК пациенток с РМЖ/РЯ для секвенирования митохондриального генома.

Клинический материал забирали с помощью стерильных одноразовых пробирок Vacutest K3 ЭДТА объемом 4 мл. ДНК выделяли методом фенол-хлороформной экстракции. Полную последовательность мтДНК амплифицировали в виде двух перекрывающихся фрагментов длиной 9065 п.н. и 11170 п.н., используя набор реагентов для амплификации длинных фрагментов «БиоМастер LR HS-ПЦР» (ООО «Биолабмикс», г. Новосибирск). ДНК-библиотеки на основе полученных ПЦР-продуктов готовили с помощью набора Nextera Flex (Illumina, США). Секвенирование выполняли на приборе MiSeq (Illumina, США), используя набор реагентов с парными прочтениями 2х150 нуклеотидов (MiSeq Micro Kit v.2 300 cycles). Варианты мтДНК определяли после выравнивания полученных последовательностей на референсную последовательность мтДНК человека (rCRS). Для проведения секвенирования было использовано оборудование ЦКП «Медицинская геномика» НИИ медицинской генетики Томского НИМЦ РАН.

Полученные результаты сравнивались с популяционным контролем 210 полных митогено-мов саха, полученных в результате проведения популяционных исследований и размещенных в базе данных нуклеотидных последовательностей – GenBank [8–17]. Чтобы идентифицировать редкие варианты, мы определили варианты с частотами аллелей <0,5 % как редкие, а с частотами >0,5 % – как распространенные по данным частоты минорных аллелей (MAF) dbSNP и Mitomap. На основе обнаруженных вариантов мтДНК в качестве исходных данных каждый индивид был отнесен к определенной митохондриальной гаплогруппе с помощью алгоритма HaploGrep (v2.4.0), основанного на PhyloTree17 [18].

Мы провели прогнозирование патогенности найденных нами мутаций. Возможное влияние аминокислотной замены на структуру и функции белка определяли по базам данных dbSNP, ClinVar, Mitomap и предикторным инструментам PolyPhen2 transf, SIFT transf, MutationAssessor transf, CHASM и MitImpact 3D [19–20]. Мы также использовали критерии патогенности, опираясь на «Рекомендации Американского колледжа медицинской генетики и геномики и Ассоциации молекулярной патологии» и российское «Руководство по интерпретации данных последовательности ДНК человека, полученных методами массового параллельного секвенирования» [21–22].

Было проведено ассоциативное исследование «случай-контроль» между пациентами с РМЖ и популяционным контролем (GenBank). Различия частот при РМЖ и в контрольной группе сравнивались для оценки ассоциаций отдельных вариантов мтДНК с риском РМЖ (критерий χ2). Значимым считались отличия при значении p<0,05 с учетом поправки Йейтса. Величина эффекта для ассоциации измерялась как отношение шансов (ОШ) с 95 % доверительным интервалом (ДИ).

Результаты

У больных РМЖ выявлено 159 вариантов митохондриального генома по сравнению с референсной последовательностью мтДНК (rCRS) [23]. Из них 147 транзиций, 5 трансверсий, 5 инсерций и 2 делеции. Некодирующий регион мтДНК содержал 34 варианта, кодирующий регион – 105, из них 13 миссенс-мутации, локус rRNA имел 16 вариантов, tRNA – 4 варианта. Варианты мтДНК пациенток саха с РМЖ были отнесены к определенной ми- тохондриальной гаплогруппе в зависимости от возраста (табл. 1).

Сравнительный анализ полученных данных пациенток саха с РМЖ с популяционным контролем (представленным 210 митогеномами саха), с базами данных dbSNP, ClinVar и Mitomap позволил выделить ряд вариантов – новых, неопределенного значения, вероятно патогенных (табл. 2). Особого внимания заслуживают 2 варианта – варианты локуса D310 и m.3107N>T, – для которых установлена ассоциация с риском развития РМЖ (p=0,002 и р=0,001 соответственно). Также нами впервые обнаружены новые варианты мтДНК в популяции саха, так как они отсутствовали в популяцион- ном контроле. Данные варианты (m.14692A>G, m.8943C>T, m.9932G>A) являются доброкачественными и не включены в табл. 2.

Далее 13 миссенс-вариантов кодирующей части мтДНК больных РМЖ в популяции саха были проанализированы с помощью программных инструментов, предсказывающих влияние на функцию белков (табл. 3). У двух пациенток с отсутствием изменений длины полицитозиновых участков по сравнению с rCRS имеются локальные мутации и новая мутация 16S rRNA, которая отсутствует в базах данных, включая популяционный контроль (больная 43 лет, саха – m.12372G>A, m.16235A>G и больная 43 лет, саха – m.16274G>A).

Таблица 1/table 1

Гаплогруппы мтДНК у пациенток саха с РМЖ в зависимости от возраста Mtdna haplogroups in sakha patients with breast cancer depending on age

Возрастные группы (годы)/	Число больныхРМЖ/	Гаплогруппы мтДНК/
Age groups (years)	Number of breast cancer patients	mtDNA haplogroups

30–39	2	M7c1a1b1, D5a2a2
40–49	9	D5a2a2, C4a1a4a (2)*, C4a, C5b1b1, C4b1, D4i2, G2a2, G2a1
50–59	3	D4c1b1, W3a1d, C4a2a1b
60 и старше/60 and older	–
Всего/ Total	14

Список литературы Вариабельность митохондриального генома у больных раком молочной железы в популяции якуток

Petrova G.V., Gretsova O.P., Kaprin A.D., Starinskii V.V. Kharakteristika i metody rascheta mediko-statisticheskikh pokazatelei, primenyaemykh v onkologii. M., 2014. 40 s.
Pisareva L.F., Odintsova I.N., Ivanov P.M., Nikolaeva T.I. Osobennosti zabolevaemosti rakom molochnoi zhelezy korennogo i prishlogo naseleniya Respubliki Sakha (Yakutiya). Sibirskii onkologicheskii zhurnal. 2007; 3: 69-72.
Nikolaeva T.I., Pisareva L.F., Ivanov P.M., Ivanova F.G. Faktory riska razvitiya raka molochnoi zhelezy v Respublike Sakha (Yakutiya). Yakutskii meditsinskii zhurnal. 2010; 1(29): 46-7.
Zlokachestvennye novoobrazovaniya v Rossii v 2021 godu (zabolevaemost' i smertnost'). Pod red. A.D. Kaprina, V.V. Starinskogo, A.O. Shakhzadovoi. M., 2022. 252 s.
Gervas P.A., Molokov A.Yu., Panferova E.V., Pisareva L.F., Cherdyntseva N.V. Etnicheskie aspekty nasledstvennogo raka molochnoi zhelezy. Sibirskii onkologicheskii zhurnal. 2019; 18(2): 102-8. https://doi.org/10.21294/1814-4861-2019-18-2-102-108.
Gervas P.A., Molokov A.Yu., Zarubin A.A., Ivanova A.A., Tikhonov D.G., Kipriyanova N.S., Egorov A.N., Zhuikova L.D., Shefer N.A., Topol'nitskii E.B., Belyavskaya V.A., Pisareva L.F., Choinzonov E.L., Cherdyntseva N.V. Novaya mutatsiya v gene PALB2, assotsiirovannaya s nasledstvennym rakom molochnoi zhelezy u molodoi patsientki, prinadlezhashchei k yakutskoi etnicheskoi gruppe. Sibirskii onkologicheskii zhurnal. 2022; 21(4): 72-9. https://doi.org/10.21294/1814-4861- 2022-21-4-72-79.
Sukhorukov V.S., Voronkova A.S., Litvinova N.A. Klinicheskoe znachenie individual'nykh osobennostei mitokhondrial'noi DNK. Rossiiskii vestnik perinatologii i pediatrii. 2015; 60(3): 10-20.
Duggan A.T., Whitten M., Wiebe V., Crawford M., Butthof A., Spitsyn V., Makarov S., Novgorodov I., Osakovsky V., Pakendorf B. Investigating the prehistory of Tungusic peoples of Siberia and the Amur-Ussuri region with complete mtDNA genome sequences and Y-chromosomal markers. PLoS One. 2013; 8(12). https://doi.org/10.1371/journal.pone.0083570.
Pala M., Olivieri A., Achilli A., Accetturo M., Metspalu E., Reidla M., Tamm E., Karmin M., Reisberg T., Hooshiar Kashani B., Perego U.A., Carossa V., Gandini F., Pereira J.B., Soares P., Angerhofer N., Rychkov S., AlZahery N., Carelli V., Sanati M.H., Houshmand M., Hatina J., Macaulay V., Pereira L., Woodward S.R., Davies W., Gamble C., Baird D., Semino O., Villems R., Torroni A., Richards M.B. Mitochondrial DNA signals of late glacial recolonization of Europe from near eastern refugia. Am J Hum Genet. 2012; 90(5): 915-24. https://doi.org/10.1016/j.ajhg.2012.04.003.
Derenko M., Malyarchuk B., Denisova G., Perkova M., Litvinov A., Grzybowski T., Dambueva I., Skonieczna K., Rogalla U., Tsybovsky I., Zakharov I. Western Eurasian ancestry in modern Siberians based on mitogenomic data. BMC Evol Biol. 2014; 14. https://doi.org/10.1186/s12862-014-0217-9.
Fedorova S.A., Reidla M., Metspalu E., Metspalu M., Rootsi S., Tambets K., Trofmova N., Zhadanov S.I., Hooshiar Kashani B., Olivieri A., Voevoda M.I., Osipova L.P., Platonov F.A., Tomsky M.I., Khusnutdinova E.K., Torroni A., Villems R. Autosomal and uniparental portraits of the native populations of Sakha (Yakutia): implications for the peopling of Northeast Eurasia. BMC Evol Biol. 2013; 13. https://doi.org/10.1186/1471-2148-13-127.
Ingman M., Gyllensten U. Rate variation between mitochondrial domains and adaptive evolution in humans. Hum Mol Genet 2007; 16(19): 2281-7. https://doi.org/10.1093/hmg/ddm180.
Achilli A., Rengo C., Battaglia V., Pala M., Olivieri A., Fornarino S., Magri C., Scozzari R., Babudri N., Santachiara-Benerecetti A.S., Bandelt H.J., Semino O., Torroni A. Saami and Berbers--an unexpected mitochondrial DNA link. Am J Hum Genet. 2005; 76(5): 883-6. https://doi.org/10.1086/430073.
Derenko M., Malyarchuk B., Grzybowski T., Denisova G., Dambueva I., Perkova M., Dorzhu C., Luzina F., Lee H.K., Vanecek T., Villems R., Zakharov I. Phylogeographic analysis of mitochondrial DNA in northern Asian populations. Am J Hum Genet. 2007; 81(5): 1025-41. https://doi.org/10.1086/522933.
Derenko M., Malyarchuk B., Grzybowski T., Denisova G., Rogalla U., Perkova M., Dambueva I., Zakharov I. Origin and post-glacial dispersal of mitochondrial DNA haplogroups C and D in northern Asia. PLoS One. 2010; 5(12). https://doi.org/10.1371/journal.pone.0015214.
Derenko M., Malyarchuk B., Denisova G., Perkova M., Rogalla U., Grzybowski T., Khusnutdinova E., Dambueva I., Zakharov I. Complete mitochondrial DNA analysis of eastern Eurasian haplogroups rarely found in populations of northern Asia and eastern Europe. PLoS One. 2012; 7(2). https://doi.org/10.1371/journal.pone.0032179.
Lippold S., Xu H., Ko A., Li M., Renaud G., Butthof A., Schröder R., Stoneking M. Human paternal and maternal demographic histories: insights from high-resolution Y chromosome and mtDNA sequences. Investig Genet. 2014; 5: 13. https://doi.org/10.1186/2041-2223-5-13.
Weissensteiner H., Pacher D., Kloss-Brandstätter A., Forer L., Specht G., Bandelt H.J., Kronenberg F., Salas A., Schönherr S. HaploGrep 2: mitochondrial haplogroup classifcation in the era of high-throughput sequencing. Nucleic Acids Res. 2016; 44: 58-63. https://doi.org/10.1093/nar/gkw233.
Lott M.T., Leipzig J.N., Derbeneva O., Xie H.M., Chalkia D., Sarmady M., Procaccio V., Wallace D.C. mtDNA Variation and Analysis Using Mitomap and Mitomaster. Curr Protoc Bioinformatics. 2013; 44(123). https://doi.org/10.1002/0471250953.bi0123s44.
Castellana S., Biagini T., Petrizzelli F., Parca L., Panzironi N., Caputo V., Vescovi A.L., Carella M., Mazza T. MitImpact 3: modeling the residue interaction network of the Respiratory Chain subunits. Nucleic Acids Res. 2021; 49: 1282-8. https://doi.org/10.1093/nar/gkaa1032.
Richards S., Aziz N., Bale S., Bick D., Das S., Gastier-Foster J., Grody W.W., Hegde M., Lyon E., Spector E., Voelkerding K., Rehm H.L.; ACMG Laboratory Quality Assurance Committee. Standards and guidelines for the interpretation of sequence variants: a joint consensus recommendation of the American College of Medical Genetics and Genomics and the Association for Molecular Pathology. Genet Med. 2015; 17(5): 405-24. https://doi.org/10.1038/gim.2015.30.
Ryzhkova O.P., Kardymon O.L., Prokhorchuk E.B., Konovalov F.A., Maslennikov A.B., Stepanov V.A., Afanas'ev A.A., Zaklyaz'minskaya E.V., Rebrikov D.V., Savost'yanov K.V., Glotov A.S., Kostareva A.A., Pavlov A.E., Golubenko M.V., Polyakov A.V., Kutsev S.I. Rukovodstvo po interpretatsii dannykh posledovatel'nosti DNK cheloveka, poluchennykh metodami massovogo parallel'nogo sekvenirovaniya (MPS) (redaktsiya 2018, versiya 2). Meditsinskaya genetika. 2019; 18(2): 3-23. https://doi.org/10.25557/2073-7998.2019.02.3-23
Andrews R.M., Kubacka I., Chinnery P.F. Lightowlers R.N., Turnbull D.M., Howell N. Reanalysis and revision of the Cambridge reference sequence for human mitochondrial DNA. Nat Genet. 1999; 23(2): 147. https://doi.org/10.1038/13779.
Ingman M., Gyllensten U. mtDB: Human Mitochondrial Genome Database, a resource for population genetics and medical sciences. Nucleic Acids Res. 2006; 34: 749-51. https://doi.org/10.1093/nar/gkj010.
Sanchez-Cespedes M., Parrella P., Nomoto S., Cohen D., Xiao Y., Esteller M., Jeronimo C., Jordan R.C., Nicol T., Koch W.M., Schoenberg M., Mazzarelli P., Fazio V.M., Sidransky D. Identifcation of a mononucleotide repeat as a major target for mitochondrial DNA alterations in human tumors. Cancer Res. 2001; 61(19): 7015-9.
Tipirisetti N.R., Govatati S., Pullari P., Malempati S., Thupurani M.K., Perugu S., Guruvaiah P., Rao K.L., Digumarti R.R., Nallanchakravarthula V., Bhanoori M., Satti V. Mitochondrial control region alterations and breast cancer risk: a study in South Indian population. PLoS One. 2014; 9(1). https://doi.org/10.1371/journal.pone.0085363.
Yacoubi Loueslati B., Troudi W., Cherni L., Rhomdhane K.B., Mota-Vieira L. Germline HVR-II mitochondrial polymorphisms associated with breast cancer in Tunisian women. Genet Mol Res. 2010; 9(3): 1690-700. https://doi.org/10.4238/vol9-3gmr778.
Tikhonov D.G., Vinokurov M.M., Kipriyanova N.S., Golubenko M.V. Rol' mitokhondrii v razvitii raka molochnoi zhelezy. Rossiiskii onkologicheskii zhurnal. 2022; 27(1): 5-19. https://doi.org/10.17816/onco110904.
Zou Y., Jia X., Zhang A.M., Wang W.Z., Li S., Guo X., Kong Q.P., Zhang Q., Yao Y.G. The MT-ND1 and MT-ND5 genes are mutational hotspots for Chinese families with clinical features of LHON but lacking the three primary mutations. Biochem Biophys Res Commun. 2010; 399(2): 179-85. https://doi.org/10.1016/j.bbrc.2010.07.051.
Ma J., Coarfa C., Qin X., Bonnen P.E., Milosavljevic A., Versalovic J., Aagaard K. mtDNA haplogroup and single nucleotide polymorphisms structure human microbiome communities. BMC Genomics. 2014; 15: 257. https://doi.org/10.1186/1471-2164-15-257.
Verma R.K., Kalyakulina A., Giuliani C., Shinde P., Kachhvah A.D., Ivanchenko M., Jalan S. Analysis of human mitochondrial genome cooccurrence networks of Asian population at varying altitudes. Sci Rep. 2021; 11(1): 133. https://doi.org/10.1038/s41598-020-80271-8.
Brandon M., Baldi P., Wallace D.C. Mitochondrial mutations in cancer. Oncogene 2006; 25(34): 4647-62. https://doi.org/10.1038/sj.onc.1209607.
Kopinski P.K., Singh L.N., Zhang S., Lott M.T., Wallace D.C. Mitochondrial DNA variation and cancer. Nat Rev Cancer. 2021; 21(7): 431-45. https://doi.org/10.1038/s41568-021-00358-w.
Tikhonov D.G., Molokov A.Yu., Belyavskaya V.A., Ananina O.A., Gervas P.A. Endogennye i ekzogennye faktory riska, vliyayushchie na uroven' zabolevaemosti naseleniya Yakutii rakom molochnoi zhelezy. Sibirskii onkologicheskii zhurnal. 2023; 22(3): 5-15. https://doi.org/10.21294/1814-4861-2023-22-3-5-15.

Еще

Статья научная