Вариации содержания теанина, метилксантинов и ряда флаваноидов в листьях и побегах чая сорта Колхида в условиях влажных субтропиков России: сезонная динамика, стадия зрелости листа, обеспеченность биогенными элементами

Вкусовые и лечебно-профилактические свойства чая зависят от содержания в нем разнообразных композиций специализированных метаболитов (флаван-3-олов, флавонолов, алкалоидов, теанина, летучих веществ и сапонинов). Одни вещества (катехины, флавонолы) относятся к сильнейшим антиоксидантам, целебность других (теанина) связана с успокаивающим эффектом, кофеин относится к стимулирующим веществам (1-4). Учитывая разнонаправленность действия этих веществ, их композиции с преобладанием той или иной группы, формируемые под влиянием различных факторов, будут определять вкусовой и лечебно-профилактический эффекты. В мировой литературе существенное внимание уделяется анализу состава метаболитов у различных генотипов чая (5-7), его изменчивости под влиянием экологических факторов (1, 3, 8, 9), молекулярно-генетическим механизмам регуляции биосинтеза этих веществ (10, 11), а также балансу метаболитов при получении конечного продукта — напитка (12).

Следует отметить, что большая часть научных исследований проведена на сортах и в экологических условиях юго-восточной Азии (Китай, Индия, Корея) (1, 3, 7, 13). На этом фоне практически не изучены промышленные перспективные сорта, произрастающие в самых северных субтропиках мира (Сочинское Причерноморье). Так, отсутствуют или имеются фрагментарными данные, касающиеся природного метаболического профиля российских сортов чая по широкой группе веществ, среди которых теанин, катехины, алкалоиды, флавонолы и их гликозиды (14, 15). Также малоизученными остаются вопросы биосинтеза этих соединений в листьях разной степени зрелости, изменчивости их содержания по сезонам и под влиянием минеральной обеспеченности растений (10, 16-18).

В настоящей работе мы впервые установили базовый метаболический профиль чая сорта Колхида, включающий несколько групп специализированных органических компонентов (флаван-3-олы, флавонолы, ме-тилксантины, теанин), который формируется в экологических условиях Сочинского Причерноморья.

Целью работы было определить содержание и диапазоны варьирования теанина и сложных вторичных метаболитов (катехинов, меликсанти-нов, флавонолов) в листьях разного возраста и побегах чая ( Camellia sinensis L.) эталонного для Черноморского побережья Российской Федерации сорта Колхида в сезонной динамике и на фоне удобрений.

Методика. Исследования проводили во влажных субтропиках России (Черноморское побережье Краснодарского края, г. Сочи, Лазаревский р-н, пос. Уч-Дере, 43°69 ‘ N, 39°64 ‘ E) в 2022-2023 годах на сортовой (сорт Колхида) полновозрастной чайной плантации (1983 год закладки), где с 1986 года ведутся полевые опыты с макро- и микроудобрениями.

Метеорологические условия региона, по многолетним наблюдениям, характеризуются среднесуточной температурой воздуха 12,8-16,5 °С и годовым количеством осадков 1400-2000 мм. Листосборный период для культуры чая длится с мая по сентябрь, выделяют две основные волны роста молодых побегов: первая — с мая по июнь, вторая — с июля по август. Между волнами роста, как правило, ежегодно присутствует фаза затухания ростовых процессов (конец июня — начало июля). Отмечаемый в летний период дефицит осадков (менее 50 мм в месяц) ингибирует ростовые процессы, что в условиях богарного чаеводства ведет к значительному снижению побегообразования.

Почва опытного участка — бурая лесная кислая окультуренная малогумусная мощная среднеглинистая, сформированная на элюво-делювии глинистых сланцев (аргиллитов).

Для оценки сезонной динамики образования и накопления метаболитов были отобраны пробы 3-листной флеши (молодой побег, состоящий из почки и трех листьев разной стадии зрелости) в периоды наиболее интенсивного флешеобразования 1-й (май, июнь) и 2-й волны роста (июль, август) на оптимальном (N 240 P 70 K 90 ) и дефицитном (N 0 P 0 K 0 ) для чая агрофоне. Для сравнительной оценки метаболического профиля листьев разной степени зрелости, а также установления влияния цинка в летний период (июль) были отобраны молодые побеги чая в двух вариантах полевого опыта, контрастных по обеспеченности почв цинком: N 240 P 70 K 90 (контроль), N 240 P 70 K 90 + Zn 4,3 (после ежегодного 15-летнего внесения сульфата цинка в поверхностный слой почвы). Части побега (почка, 1-й лист, 2-й лист, 3-й лист) были сгруппированы.

Все отобранные в опытах растительные пробы фиксировали над водяным паром в течение 1-3 мин для нейтрализации ферментативных процессов, после чего высушивали до абсолютно сухого состояния. Далее к точной навеске (130-175 мг) листьев чая в герметичной стеклянной виале приливали 4 мл 80 об.% водного раствора метанола, виалу закрывали на 1 нед для экстрагирования.

Перед анализом метанольные экстракты чая центрифугировали при 13 000 об/мин в течение 10 мин (5415R, «Eppendorf», Германия). Содержание специализированных компонентов в растительных пробах — кофеина, теобромина, теанина, (+)-катехина (К), (-)-эпикатехина (ЭК), (+)-галлока-техина (ГК), (-)-эпигаллокатехина (ЭГК), (-)-катехин-3-галлата (KГ), (-)-эпикатехин-3-галлата (ЭКГ), (-)-галлокатехин-3-галлата (ГКГ), (-)-эпига-локатехин-3-галлата (ЭГКГ), рутина, гликозидов флавонолов (кверцетина и кемпферола) — оценивали методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) на хроматографе фирмы «Agilent Technologies» (модель 1100, США) (3). Все определения проводили в трех биологических и трех аналитических повторностях.

Статистический анализ данных проводили с использованием программного обеспечения XLSTAT . Для выявления значимых различий между различными вариантами эксперимента использовали критерий Тьюки (p ≤ 0,05). На графиках и в таблице отображены средние значения (M) и стандартные ошибки средних (±SEM).

Результаты. Насыщенный вкус чая и его оздоровительные свойства во многом объясняются накоплением множества соединений как первичного, так и вторичного обмена, среди которых присутствуют катехины (фла-ван-3-олы), небелковая аминокислота теанин, пуриновый алкалоид кофеин, гликозиды кверцетина и кемпферола, а также группа летучих веществ (терпеноиды и сапонины) (5, 12). Катехины и флавонолы придают чаю вяжущий и горький вкус, теанин — мягкость и сладкий вкус, кофеин и чайные сапонины — горький вкус, летучие вещества — специфически приятные и запоминающиеся ароматы (12, 19-21). В ответ на меняющиеся экологические условия происходит метаболомное и транскриптомное перепрограммирование растений чая, способствующее разнообразию вкусов и свойств напитка (21, 22).

Известно, что образование и накопление различных типов и модификаций катехинов значительно варьирует при смене экологических условий (2, 6, 7, 9). В настоящем исследовании в условиях влажных субтропиков России мы отмечали наиболее высокое накопление этих соединений в 3листной флеши чайного растения (170-250 мг/г) (рис. 1) в сравнении с другими чаепроизводящими регионами мира (50-200 мг/г) (1, 5, 6).

Рис. 1. Сезонная динамика содержания простых (А) и галлированных (Б) катехинов в 3-листной флеши чайного растения ( Camellia sinensis L.) сорта Колхида при выращивании на фоне N 0 P 0 K 0 (слева) и N 240 P 70 K 90 (справа) : а — май, б — июнь, в — июль, г — август; К — катехины, ГК — галлокатехины, ЭК — эпикатехины, ЭГК — эпигаллокатехины, ГКГ — галлокатехин-галлаты, ЭКГ — эпикатехин-галлаты, ЭГКГ — эпигаллокатехин-галлаты, Σ — сумма катехинов ( n = 3, N = 3, M ±SEM; Краснодарский край, г. Сочи, 2022-2023 годы).

* Различия с показателем предыдущего месяца статистически значимы при p ≤ 0,05.

** Различия с контролем статистически значимы при p ≤ 0,05.

Из группы простых катехинов в листьях и побегах чая максимальным было содержание эпи-тип катехинов с цис-конфигурацией (ЭК, ЭГК), о доминировании которых сообщалось и в других работах (23, 24). Количество галловой кислоты (прекурсора в синтезе галлированных катехинов) варьировало в течение сезона от 0,53 мг/г в мае до 0,15 мг/г в августе. Из группы галлированных катехинов (олигомеров катехинов) в листьях чая преобладал ЭГКГ, содержание ЭКГ было меньше в 3-4 раза, ГКГ — на порядок (см. рис. 1). В целом суммарное содержание галлированных катехинов в 3-листной флеши чайного растения превышало количество простых катехинов почти на порядок (см. рис. 1), что свидетельствовало о сильном антиоксидантном потенциале растительного сырья. Известно, что в порядке убывания антиоксидантной активности стандартные катехины формируют следующий ряд: ЭГКГ ≥ ГКГ ≥ ЭКГ >ЭГК ≥ ГК ≥ ЭК ≥ К (25, 26).

По сезонам было отмечено увеличение содержания катехинов в 3листной флеши чайного растения от мая к июлю-августу, что обусловлено сезонной аридизацией метеоусловий (усилением засухи и гипертермии от весенних к летним месяцам). Это согласуется с мнением многих исследователей, что засуха и высокие температуры способны выступать в роли индукторов биосинтеза фенольных соединений, которые защищают клетки от действия активных форм кислорода (27-29). Предполагается, что в стрессовых условиях ростовые процессы подавляются в большей степени, чем фотосинтез, а фиксированный углерод преимущественно распределяется во вторичные метаболиты (27, 30, 31). Еще одним фактором, влияющим на процессы образования и накопления катехинов, служит минеральная обеспеченность растений чая (2, 13, 21, 30). В нашем исследовании при минеральной недостаточности (вариант N 0 P 0 K 0 ), которая, по-видимому, распознается растениями как стресс, отмечалось накопление простых, в меньшей степени галлированных катехинов (см. рис. 1), при снижении теанина в среднем в 2 раза (рис. 2).

Содержание кофеина в 3-листной флеши чайного растения (2535 мг/г) в целом было сопоставимо с данными других исследователей (1545 мг/г) (18, 32, 33) и характеризовалось менее выраженной сезонной динамикой (см. рис. 2). Также установлено, что его содержание в листьях чая первой волны роста (май, июнь) было ниже на фоне минеральной недостаточности (N 0 P 0 K 0 ) в сравнении с NPK-удобрениями.

Рис. 2. Сезонная динамика содержания теанина и кофеина в 3-листной флеши чайного растения ( Camellia sinensis L.) сорта Колхида при выращивании на фоне N 0 P 0 K 0 (слева) и N 240 P 70 K 90 (справа) : а — май, б — июнь, в — июль, г — август ( n = 3, N = 3, M ±SEM; Краснодарский край, г. Сочи, 2022-2023 годы).

* Различия с показателем предыдущего месяца статистически значимы при p ≤ 0,05.

** Различия с контролем статистически значимы при p ≤ 0,05.

О тесной корреляции содержания кофеина и азота в листьях чая ( r = 0,84, p ≤ 0,05) мы сообщали ранее (15). Значительно меньше (на порядок) в листьях чая содержалось теобромина (2,0-3,5 мг/г).

Содержание теанина в 3-листной флеши чайного растения варьировало в пределах 3-12 мг/г, что в целом выше значений, полученных для чая, произрастающего в других регионах мира (6, 34, 35). Сезонная динамика образования и накопления этого соединения (снижение от мая к августу), по аналогии с другими регионами (6, 36), приурочена к потребностям растений в азоте и его доступности из почвы и удобрений. Ранее в модельном эксперименте мы доказали, что индуцирование синтеза теанина в листьях чая обеспечивается за счет его высокой обеспеченности азотом (15).

О-гликозиды кверцетина и кемпферола — преобладающие формы флавонолов в свежем чайном листе (7, 37). Несмотря на их более низкое содержание по сравнению с катехинами, эти соединения, вносят важный вклад в вяжущий и горьковатый вкус чайного настоя (37, 38), а их количество варьирует в зависимости от ряда факторов (12). Содержание рутина (гликозид кверцетина) в течение сезона изменялось от 0,95 до 1,76 мг/г, при этом не было отмечено связей с агрофоном или сезоном. Содержание ряда других О-гликозидов кверцетина и кемферолла варьировало соответственно от 1,6 до 3,2 мг/г и от 0,4 до 3,0 мг/г, снижаясь от мая к августу по аналогии с теанином. Наибольшее количество этих О-гликозидов накапливалось в листьях чая на оптимальном агрофоне (N 240 P 70 K 90 ).

Сезонные флуктуации соотношения изученных метаболитов в чайном листе будут определять вкус и свойства напитка. Так, китайские исследователи (12) отмечают, что высокое содержание катехинов, а также теафла-винов служит информативным маркером для производства черного чая. В свою очередь, для производства неферментированного зеленого чая благоприятно повышенное содержание свободных сахаров и аминокислот и пониженное — катехинов и фенольных кислот в исходном сырье (11). Исходя из этого, можно констатировать, что чай, изготовленный из растений сорта Колхида первой волны роста (май, июнь) с высокой долей теанина, можно использовать для производства зеленого чая, который будет обладать более мягким вкусом и воздействием на нервную систему (34, 35). В свою очередь, из сырья второй волны роста (июль, август) с высокой долей катехинов и кофеина более рационально производить черный чай, который будет обладать более высокой антиоксидантной активностью и выраженным стимулирующим эффектом (12, 32).

Известно, что качество чайного сырья и готового продукта также зависит от зрелости чайного листа во время сбора (23, 24). Многие исследователи, отмечая общую закономерность накопления кофеина, теанина и ЭГКГ в более молодых листьях чайного растения, указывают на сортовую специфику перераспределения этих веществ (23, 24, 39). В дополнение к этому имеются данные, что по мере созревания листа в нем в основном увеличивалось количество нетерпеноидов (например, гексенолов), что придает напитку нежелательный травянистый привкус (40). При этом в более молодых листьях чая было больше терпеноидов (линалоол и гераниол), которые придавали напитку сладкий цветочный аромат и улучшали качество чая (41).

Для сорта Колхида установлено, что 3-й, самый зрелый, лист содержал максимальное количество простых катехинов (ЭК, ЭГК и ГК) и минимум галлированных катехинов, а также кофеина (табл., рис. 3). Более молодые части побега (почка, 1-й лист) накапливали теанин, кофеин, теобромин, а также галлированные катехины. Исследователи связывают дифференциацию образования и накопления метаболитов в разных частях побега с усилением фотосинтеза и снижением способности к биосинтезу флавоноидов по мере взросления листьев (23).

Содержание простых и галлированных катехинов (мг/г) в листьях чайного растения ( Camellia sinensis L.) сорта Колхида при различной обеспеченности почв цинком ( n = 3, N = 3, M ±SEM; Краснодарский край, г. Сочи, 2022-2023 годы)

Показатель	Стадия развития листа
	почка	1-й лист	2-й лист	3-й лист	среднее
Сумма простых катехинов	8,6±0,44	12,6±0,60	22,9±0,81	23,9±0,96	17,0±7,57
	9,3±0,52	15,5±0,53*	19,9±0,65	23,4±0,89	17,0±6,09
Сумма галлированных катехинов	228,0±6,24	245,8±7,72	209,1±5,21	157,2±5,03	210,0±38,26
	220,7±7,38	241,0±6,98	220,9±6,32*	162,6±5,24	211,3±33,86
Общее количество катехинов	236,6±7,06	258,3±6,35	231,9±5,89	181,1±2,32	227,0±32,69
	230,0±6,56	256,5±5,32	240,7±4,12	186,0±5,62	228,3±30,26
Примечание. В числителе —	N 240 P 70 K 90 (контроль), в знаменателе — N 240 P 70 K 90 + Zn 4,3 .
* Различия с контролем статистически значимы при p ≤ 0,05.

В последние годы все большую актуальность приобретает агрономическое биообогащение сельскохозяйственной продукции эссенциальными микроэлементами. Особый интерес представляет дефицитный (2-4 мг/кг) в чаепригодных почвах различных регионов мира, в том числе в РФ, микроэлемент цинк (42). Предполагается, что цинк, будучи структурным компонентом антиоксидантных ферментов, играет значимую роль в синтезе комплекса антистрессовых соединений (43). Рекомендуемое потребление Zn для человека составляет 11,5-15,0 мг/сут (43), его поступление из чайного настоя — около 0,14 мг/сут, а его токсичность возникает при длительном приеме более 150 мг/сут (44). Ранее в этом же опыте было установлено (45), что внесение цинка с удобрениями увеличивало его содержание в почвах с 1,5-3,0 мг/кг до 10-15 мг/кг, что закономерно повышало его содержание в молодых побегах чайного растения в 1,3-1,5 раза, достигая 34,1-52,9 мг/кг (31,2-41,1 мг/кг в контроле). На этом фоне также менялся и метаболический профиль листьев (см. табл., рис. 3). Так, было установлено, что в отличие от контрольного варианта, 1-й и 3-й лист побега содержали больше теанина, что отмечали и T. Yang с соавт. (2).

Рис. 3. Содержание теанина (слева) и кофеина (справа) в почках (а) , 1-м (б) , 2-м (в) и 3-м (г) листьях чайного растения ( Camellia sinensis L.) сорта Колхида разного возраста при различной обеспеченности почв цинком: контроль — N 240 P 70 K 90 , Zn — N 240 P 70 K 90 + Zn 4,3 ( n = 3, N = 3, M ±SEM; Краснодарский край, г. Сочи, 2022-2023 годы).

* Различия с показателем предыдущего листа статистически значимы при p ≤ 0,05;

** Различия с контролем статистически значимы при p ≤ 0,05.

Как уже отмечалось выше, накопление в чае теанина способствует повышению его качества не только из-за улучшения вкуса (свежесть и вкус умами), но также из-за его биологической активности (35, 36). По содержа- нию алкалоидов растения, произрастающие на разных фонах цинка в среднем не различались, хотя в литературе сообщалось о накоплении кофеина при использовании цинка, как компонента удобрения (2). Отмечены также различия с контрольным вариантом по содержанию некоторых катехинов в листьях разного возраста, однако при их суммировании оно было соизмеримо.

Таким образом, образование и накопление различных классов и модификаций флаваноидов, метилксантинов и теанина в листьях и побегах чайного растения сорта Колхида смещается при варьировании метеоусловий и содержания биогенных элементов в почвах, а также в зависимости от возраста листа, что приводит к формированию особенных композиций, которые определяют его вкус и полезные свойства. В весенний период (май) 3-листные флеши чайного растения содержали в 2 - 3 раза больше теанина, меньше катехинов и кофеина. В летний период, на фоне засухи и гипертермии, растения накапливали в среднем на 20 % больше катехинов и значительно меньше теанина. Молодые части 3-листной флеши (почка, 1-й лист) характеризовались накоплением наиболее активных антиоксидантов (гал-лированных катехинов), кофеина и теанина. Растения чая, произрастающие на более высоком фоне цинка в почве, отличались повышенным содержанием теанина (на 20 %) в листьях. При длительном NPK-дефиците во флешах первой волны роста (май, июнь) отмечено усиление биосинтеза простых катехинов (в среднем на 20 %) при снижении количества теанина (в 2 раза) и кофеина (в 1,2 раза).