Верификация стромального клеточного фактора SDF-1 в гравидарном эндометрии при неразвивающейся беременности после применения технологий экстракорпорального оплодотворения

Введение . Репродуктивные потери первого триместра остаются актуальной проблемой современного общества. К сожалению, следует признать, что, несмотря на определенные успехи и внедрение новых технологий в репродуктивную медицину, частота репродуктивных потерь достигает 20% с преобладанием неразвивающейся беременности, как при естественно наступившей беременности, так и при беременности после экстракорпорального оплодотворения (далее – ЭКО), не имея тенденции к снижению [1-4]. Полиэтиологичность ранних самопроизвольных выкидышей не вызывает сомнений [5-6] и большая часть их этиологических аспектов хорошо изучена, однако влияние иммунологического фактора в генезе репродуктивных потерь остается не до конца ясным в связи с множественными патогенетическими механизмами иммунологических взаимодействий в системе мать-плацента-плод [7-11].

Последние годы особую роль в патогенезе репродуктивных потерь отводят хе-мокинам. В эксперименте как in vitro, так и in vivo показано, что хемокины участвуют в гра-видарной трансформации эндометрия и успешной инвазии трофобласта в комплексе с другими медиаторами [12-13]. Показано, что процесс инвазии трофобласта, обусловленный полноценным взаимодействием бластоцисты и эндометрия, является приоритетным моментом последующего развития беременности и особая роль отводится молекулам фактора CXCL12 (SDF-1 - Stromal cell-derived factor-1), синтезируемому клетками трофобласта и эндометрия, как фактору, потенцирующему восприимчивость эндометрия к наступлению и развитию беременности [1417]. В эксперименте на модели животных также продемонстрирована значимость CXCL12, как фактора, принимающего непосредственное участие в прегравидарной подготовке эндометрия и процессов нидации эмбриона [18].

Цель исследования: изучить особенности экспрессии стромального клеточного фактора SDF-1 в гравидарном эндометрии при неразвивающейся беременности после применения технологий экстракорпорального оплодотворения.

Материалы и методы исследования. Гистологическое и иммуногистохимическое исследование проведено на отобранных к исследованию 92 образцах абортивного материала, поступившего в патологоанатомическое отделение Научно-исследовательского института акушерства, гинекологии и репро-дуктологии имени Д.О. Отта, 77 образцах абортивного материала после неразвиваю-щейся беременности наступившей после применения ЭКО (5-8 недель) и 15 образцах абортивного материала развивающейся беременности, прерванной хирургическим путем (5-8 недель). Операционный материал фиксировали в 10% нейтральном формалине, далее обезвоживали в гистологическом процессоре в спиртах нарастающей концентрации, заливали в парафин и изготавливали срезы толщиной 3-4 мкм. После депарафинирования окрашивали препараты гематоксилином и эозином. При световой микроскопии (увеличениях ×100, ×200, ×400) оценивали полноценность изменений стромы и желез эндометрия (компактного и спонгиоз-ного слоев), состояние клубков спиральных артерий, степени трофобластической инвазии в зоне плацентарного ложа. Иммуногистохимическое исследование проводили на парафиновых срезах. В качестве системы визуализации использовали Abcam Mouse and Rabbit Specific HRP Plus (ABC) Detection IHC Kit (RTU)[ab93697], (Abcam, Великобритания). Для проведения иммуногистохимической реакции использовали одноэтапный протокол с демаскировкой антигена. Оценку экспрессии клеточного стромального фактора проводили с использованием первичных поликлональных кроличьих антител к Anti-SDF1 [клон ab 9797] в стандартном разведении (1:100) производства Abcam (Великобри- тания). Визуализацию экспрессии SDF 1 проводили на микроскопе Olympus BX46 и программного обеспечения «CellSens 47 Entry». Экспрессию изучаемого маркера рассчитывали с помощью программы ВидеоТест-Морфология 5.2 (Россия) на 5 микрофотографиях с каждого микропрепарата. Параметры распределения в выборках оценивали с помощью критерия Колмогорова– Смирнова. Данные представлены в виде среднего и 95% доверительного интервала -М (95% ДИ). Для определения статистически значимых различий между количественными параметрами нормально распределенных данных исследуемых групп использовали однофакторный дисперсионный анализ (ANOVA) с расчетом 95% доверительного интервала. Различия считали значимыми при p<0,05.

Результаты исследования и обсуждение. Результаты гистологического исследования показали, что гравидарная трансформация эндометрия неразвивающейся беременности после применения ЭКО характеризуется полиморфными вариантами. Исходя из гистологической картины, в зависимости от морфологического варианта гравидарной трансформации эндометрия было сформировано 5 групп: I группа - полноценная гра-видарная трансформация стромы и желез эндометрия (n=20); II группа - полноценная гравидарная трансформация стромы с железами секреторного типа (n=15); III группа -неполноценная гравидарная трансформация стромы с железами секреторного типа (n=15); IV группа - неполноценная гравидарная трансформация стромы с железами пролиферативного типа (n=15); V группа - неполноценная секреторная трансформация с железами секреторного и пролиферативного типа (n =12) и контрольная группа (n =15).

Полноценная гравидарная трансформация эндометрия контрольной группы и I группы имела сходные и черты и была представлена зрелыми децидуоцитами, формирующими эпителиальный пласт и щелевидными железами с низким кубическим эпителием. Клубки спиральных артерий крупные, толстостенные, инвазия трофобласта в зоне плацентарного ложа была умеренной.

Рис. 1. Полноценная трансформация желез и стромы эндометрия при неразвива-ющейся беременности. Окр.: гематокси-лином-эозином. Ув.: х400.

Рис. 2. Полноценная трансформация желез и стромы эндометрия при неразвива-ющейся беременности после ЭКО. Окр.: гематоксилином-эозином. Ув.: х400.

Гравидарный эндометрий II группы также характеризовался полноценной трансформацией, однако железы соответствовали секреторной фазе цикла с пузырьковидными ядрами, высоким призматическим эпителием и апокриновой секрецией. Изменений со стороны клубков спиральных артерий и инвазии трофобласта не выявлено. Неполноценная гравидарная трансформация эндометрия III группы была представлена незрелыми деци-дуоцитами звездчатой формы, расположенными разрозненно в отечной строме с наличием плазмоцитарно-моноцитарной инфильтрации разной степени выраженности. Железы эндометрия имели черты секреторной фазы цикла. Клубки спиральных артерий были развиты слабо, наблюдалась умеренная или слабая инвазия трофобласта в зоне плацентарного ложа.

В IV группе исследования строма состояла из предецидуальных клеток и незрелых децидуоцитов с отеком и инфильтрацией клетки мононуклеарной ряда. Железы эндометрия были тубулярного или слабо извитого строения с пикнотическим ядром, слабо раз- витой цитоплазмой с ровным апикальным краем, клубки спиральных артерий недоразвиты, инвазия трофобласта слабая. В V группе в отечной неполноценной гравидарно измененной строме определялись железы, соответствующие секреторной и пролиферативной фазе цикла с тонкостенными мелкими клубками спиральных артерий и слабой инвазией трофобласта в зоне плацентарного ложа.

Рис. 3. Полноценная трансформация стромы эндометрия с железами секреторного типа при неразвивающейся беременности после ЭКО. Окр.: гематоксилином-эозином. Ув.: х400.

Рис. 4. Неполноценная трансформация стромы эндометрия с железами секреторного типа при неразвивающейся беременности после ЭКО. Окр.: гематоксилином-эозином. Ув.: х400.

Рис. 5. Неполноценная трансформация стромы эндометрия с железами пролиферативного типа при неразвивающейся беременности после ЭКО. Окр.: гематоксили-ном-эозином. Ув.: х400.

Рис. 6. Неполноценная трансформация стромы эндометрия с железами секреторного и пролиферативного типа при нераз-вивающейся беременности после ЭКО. Окр.: гематоксилином-эозином. Ув.: х400.

Результаты иммуногистохимического исследования показали снижение экспрессии SDF-1 в железах гравидарного эндометрия при неразвивающейся беременно- сти после ЭКО по сравнению с контрольной группой (табл. 1).

Достоверное снижение экспрессии SDF-1 в железах гравидарного эндометрия при неразвивающейся беременности после ЭКО по сравнению с контрольной группой верифицировано во II группе при полноценной гравидарной трансформации стромы с железами секреторного типа (p<0,001), IV группе при неполноценной гравидарной трансформации стромы с железами пролиферативного типа (p<0,001) и V группе с неполноценной гравидарной трансформации с железами секреторного и пролиферативного типа (p<0,001).

Сравнение внутри групп показало, что в эндометрии IV группы (неполноценная гравидарная трансформация стромы и

Таблица 1

Экспрессия стромального клеточного фактора в железах гравидарного эндометрия M(95% ДИ)/M(95% CI)

Группы/Groups	Среднее значение/ Average meaning	95% доверительный интервал для среднего значения/95% confidence interval for mean		F-statistics ANOVA
		Нижняя граница/ Lower bound	Верхняя граница / Upper bound
Контрольная (n=15)	22,43	20,99	23,87	14,455
I группа (n=20)	20,32	16,97	23,66
II группа (n=15)	15,17	13,64	16,70
III группа (n=15)	18,57	16,06	21,07
IV группа (n=15)	10,43	9,35	11,52
V группа (n=12)	16,11	14,71	17,52

Примечание: k - контрольная группа; p^k-1=1,000; p^k-2<0,001; p^k-3=0,381; p^k-4<0,001; p^k-5<0,001; p^1- 2 =0,034; p 1-3 =1,000; p¹ ~ ⁴ ~ <0,001; p 1- ⁵=0,143; p² ~ ³=1,000; p² — ⁴=0,028; p² — ⁵=1,000; p³ — ⁴<0,001; p³ — ⁵=1,000; p⁴ - ⁵=0,020.

При оценке экспрессии маркера в стромальном компоненте гравидарного эндометрия верифицировано достоверное повышение в I группе при полноценной гравидарной трансформации желез и стромы эндометрия (p<0,001), а также достоверное снижение экспрессии во II группе при наличии желез секреторного типа (p<0,055) по сравнению с контрольной группой (табл. 2).

Экспрессия SDF-1 в полноценном гравидарном эндометрии была достоверно выше в I группе по сравнению с II, III и V группами (p<0,001). Во II группе с полноценной гравидарной трансформацией стромы и железами секреторного типа экспрессия данного маркера была достоверно железы пролиферативного типа) отмечается достоверное снижение экспрессии маркера (p<0,001) по сравнению с I группой (полноценная гравидарная трансформация стромы и желез). Аналогичные данные получены при сопоставлении III и IV групп. Снижение экспрессии SDF-1 в железах гравидарного эндометрия после ЭКО, вероятно, связано с нарушением его синтеза гранулоцитами еще на этапе циклической трансформации эндометрия, что согласуется с данными Tsutsumi et al [19].

ниже по сравнению с III и IV группой (р<0,001).

Полученные результаты сравнения внутри групп позволяют сделать вывод о том, что достоверное повышение экспрессии SDF-1 в абортивном материале после ЭКО связано с неполноценной гравидар-ной трансформацией желез и стромы, а также слабым развитием клубков спиральных артерий и нарушением процессов инвазии трофобласта в зоне плацентарного ложа. Несмотря на полноценность грави-дарных изменений в I группе, также выявлено достоверно повышение экспрессии при сравнении с контрольной группой, что свидетельствует о нарушениях рецепторного профиля в эндометрии [20].

Таблица 2

Экспрессия стромального клеточного фактора в строме гравидарного эндометрия M(95% ДИ)/M(95% CI)

Группы/Groups	Среднее значение/ Average meaning	95% доверительный интервал для среднего значения/95% confidence interval for mean		F-statistics ANOVA
		Нижняя граница/ Lower bound	Верхняя граница / Upper bound
Контрольная (n=15)	26,19	24,13	28,25	14,455
I группа (n=20)	40,05	35,79	44,31
II группа (n=15)	21,30	18,91	22,77
III группа (n=15)	29,39	26,61	32,17
IV группа (n=15)	33,18	30,72	35,64
V группа (n=12)	28,27	26,61	30,89

Примечание: k - контрольная группа; p^{k - 1}<0,001; p^k-2<0,055; p^k-3=1,000; p^k-4=0,025; p^k-5=1,000; p^1-2<0,001; p 1- ³<0,001; p 1- ⁴=0,031; p 1- ⁵<0,001; p² -3 <0,001; p² - ⁴<0,001; p² - ⁵=0,003; p 3- ⁴=1,000; p 3- ⁵=1,000; p⁴ -5 =0,619.

Рис. 11. Экспрессия SDF-1 в неполноценной трансформированной строме с железами пролиферативного типа при нераз-вивающейся беременности после ЭКО. Ув.: х400.

Рис. 12. Экспрессия SDF-1 в не полноценной трансформированной строме с железами секреторного и пролиферативного типа при неразвивающейся беременности после ЭКО. Ув.: х400.

Гинекологический статус пациенток, планирующих протокол ЭКО, указывает на высокую частоту воспалительных заболеваний полости матки с развитием гипоксии эндометрия, активацией патологического неоангиогенеза и последующим формированием эндометриальной дисфункции [21-24].

Стромальный клеточный фактор кроме непосредственно контроля инвазии трофобласта сопровождает и моделирует процессы ангиогенеза в эндометрии. Повышенная секреция SDF-1 связана с повреждением тканей, в том числе, обусловленном гипоксией с последующим замедлением роста и дифференцировки клеток [25]. Полученные нами результаты подтверждают данные исследования и позволяют рассматривать SDF-1 не только как фактор, связанный с нарушением гравидарной трансформации, сосудистой патологией и