Вирус нодулярного дерматита, выделенный в 2015 году в России от крупного рогатого скота, проявляет патогенность для овец при экспериментальном заражении

Нодулярный дерматит крупного рогатого скота (КРС) (заразный узелковый дерматит, злокачественный узелковый дерматит, бугорчатка, Dermatitis nodularis bovum) — трансмиссивная вирусная болезнь КРС, характеризующаяся появлением многочисленных нодул (узелков) в коже, эпителии слизистых оболочек ротовой и носовой полостей, пищевода, трахеи, бронхов. В естественных условиях клинические признаки заболевания наблюдали у КРС, африканских буйволов ( Syncerus caffer ), спрингбоков ( Antidorcas marsupialis ), сернобыков ( Oryx leucoryx , O. gazelle ) (1, 2).

Возбудитель нодулярного дерматита — ДНК-содержащий вирус семейства Poxviridae (род Capripoxvirus ) (3, 4). Источником инфекции служат больные особи, а также животные-вирусоносители с бессимптомной формой болезни (5). Вирус нодулярного дерматита передается главным образом трансмиссивно. В экспериментах C.M. Chihota (6) показано, что вирус нодулярного дерматита могут передавать комары Aedes aegypti в течение 26 сут после того, как возбудитель попал в организм насекомого с кровью инфицированного животного. У иксодовых клещей родов Rhipicephalus , Am- 438

blyomma и Hyalomma , обитающих в Южной Африке, также установлена способность механически передавать вирус восприимчивым животным (7, 8). Есть указания на связь между вспышками нодулярного дерматита и активностью осенней мухи-жигалки ( Stomoxys calcitrans ) (9). Контактный путь передачи вируса нодулярного дерматита не доказан: так, в экспериментах V.M. Carn и R.P. Kitching (10) интактные животные, находившиеся в течение 1 мес в одном боксе с инфицированными, оставались клинически здоровыми на протяжении всего срока наблюдения.

При первичном заносе инфекции в ранее благополучные регионы рекомендуется применять стемпинг аут (stamping out, подворный убой скота) с проведением радикальных карантинных мероприятий (11).

Помимо образования узелков в коже, вирус нодулярного дерматита вызывает у КРС лихорадку, лимфаденопатию, отеки подкожной клетчатки и внутренних органов, конъюнктивиты, снижение удоев молока, половую стерильность. Чистопородные животные более восприимчивы к этой инфекции, наиболее тяжело болезнь протекает у молодняка, недостаточно упитанных особей, лактирующих коров. Летальность составляет от 4 до 95 % (12-14).

Инкубационный период при экспериментальном заражении КРС вирусом нодулярного дерматита — 2-5 сут. У больных животных регистрируется виремия в течение 1-2 нед. Диссеминация вируса приводит к поражению слизистых оболочек, слюнных и молочных желез, тестикул и других органов. Через 6-9 сут после экспериментального заражения КРС на месте инокуляции вируса появляются узелки диаметром около 1 см, на 1214-е сут температура повышается до 40,5 ° С. Генерализованная форма болезни характеризуется появлением нодул на коже на всех участках тела животного. Образование нодул сопровождается воспалением подкожной клетчатки, а иногда и мышечной ткани. Вследствие вторичной бактериальной инфекции возникает воспаление лимфатических узлов и образуются язвы на коже (15, 16).

Первые случаи нодулярного дерматита в России были зафиксированы в 2015 году у крупного рогатого скота в пограничных с Азербайджаном и Грузией селах Тляратинского района Республики Дагестан. Позднее нодулярный дерматит выявили у крупного рогатого скота в Наурском районе Чеченской Республики и Кировском районе Республики Северная Осетия-Алания (21-23). По данным Информационно-аналитического отдела Россельхознадзора, в Российской Федерации в 2016-2017 года вспышки нодулярного дерматита КРС регистрировали в Республике Дагестан, в Республике Башкортостан, в Волгоградской, Саратовской, Самарской и Оренбургской областях (24).

Для эффективной защиты от нодулярного дерматита необходимо углубленное изучение всех звеньев эпизоотического процесса. Однако работ по исследованию патогенности вируса нодулярного дерматита для мелкого рогатого скота и диких жвачных животных в настоящее время недоста-439

точно для оценки роли таких животных в передаче вируса. В литературе этому вопросу посвящены лишь отдельные публикации. Так, М.С. Кукушкина с соавт. (25) провели экспериментальное заражение взрослых овец вирусом нодулярного дерматита (штамм 95) и показали, что вирус слабопатогенен для овец, вызывает образование нодул в точках введения и лихорадку. Ранее сообщалось о патогенности вируса нодулярного дерматита для диких животных — импалы ( Aepyceros melampus ) и жирафа ( Giraffe camelopardalis ), которые оказались восприимчивыми при экспериментальному заражении: животные обоих видов пали на 6-15-е сут после заражения (26).

Мы впервые оценили патогенность российского полевого изолята вируса нодулярного дерматита, выделенного от КРС на территории Республики Северная Осетия—Алания в 2015 году, для овец. Наблюдения показали, что степень тяжести клинических проявлений у инфицированных животных соответствовала 2 баллам по 10-балльной шкале (10). Вирус обнаруживался в крови при ПЦР-анализе и прямом выделении в культуре клеток почки овцы (ПО ВНИИВВиМ), а также в легких и селезенке. Эти факты подтверждают слабую патогенность вируса нодулярного дерматита для овец при инфицировании, однако указывают на возможность участия этих мелких жвачных животных в трансмиссивной передаче вируса.

Цель работы заключалась в изучении патогенности полевого изоля-та вируса нодулярного дерматита, выделенного от крупного рогатого скота в 2015 году, при экспериментальном заражении овец.

Методика. Биоптаты кожных узелков от больных нодулярным дерматитом коров из Республики Северная Осетия—Алания были отобраны сотрудниками ветеринарной службы республики в 2015 году и сохранялись до изучения в термоконтейнере (+4^+10 ° С). Биоптат растирали в фарфоровой ступке с фосфатно-солевым буфом. Полученную 10 % суспензию осветляли центрифугированием и использовали для заражения подопытных животных и выделения ДНК с целью идентификации возбудителя.

Вирусную ДНК для секвенирования и ПЦР-анализа выделяли с использованием набора РИБО-сорб (ЗАО «ИЛС», г. Москва).

Вирусную геномную ДНК в пробах биоматериала от экспериментально инфицированных животных выявляли по методике, предложенной T.R. Bowden с соавт. (27), с использованием олигонуклеотидных праймеров CaPV 074 F 1 (5´-AAAACGGTATATGGAATAGAGTTGGAA-3´), CaPV 074 R 1 (5´-AAATGAAACCAATGGATGGGATA-3 ′ ´) и гибридизационного зонда CaPV-074P 1 (5´-FAM-TGGCTCATAGATTTCCT-MGB-NFQ-3´). Реакционная смесь включала 10 пM каждого праймера, 3 пM флуоресцентного зонда (ЗАО «Синтол», Россия), 2,5 мкл 10½ ДНК-буфера, 10 мM смеси dNTPs и 1,5 IU рекомбинантной Taq ДНК-полимеразы («Thermo Fisher Scientific», США). ПЦР в реальном времени проводили на детектирующем термоциклере Rotor Gene 6000 («Corbette Research», Австралия) по следующей программе: предварительная денатурация ДНК при 95 ° С в течение 10 мин и 45 циклов амплфикации (95 ° С — 15 с, 60 ° С — 1 мин).

Фрагменты гена GPCR амплифицировали методом ПЦР на термоциклере Palm Cycler («Corbett Research», Австралия) и секвенировали по методу Сэнгера на генетическом анализаторе 3130xl Genetic Analyzer («Ap-plied Biosystems», США). Амплификацию выполняли согласно протоколу, предложенному С. Le Goff с соавт. (28), с использованием олигонук-леотидных праймеров (5´-TTAAGTAAAGCATAACTCCAACAAAAATG-3´ и 5´-TTTTTTTATTTTTTATCCAATGCTAATACT-3´) и набора Encyclo Plus PCR kit (ЗАО «Евроген», Россия). ПЦР проводили на термоциклере Gradient Palm Cycler («Corbett Research», Австралия) по следующей программе:

предварительная денатурация ДНК при температуре 94 ° С в течение 3 мин и 35 циклов амплификации (94 ° С — 30 с, 60 ° С — 30 с, 72 ° С — 60 с).

Филогенетический анализ полученной нуклеотидной последовательности проводили с использованием программы MEGA 7.0 , филогенетическое дерево строили с помощью алгоритма Neighbor Joining.

Инфекционную активность вирусосодержащей 10 % суспензии биоптата определяли на 2 клинически здоровых телятах калмыцкой породы 6-месячного возраста (живая масса 210-220 кг) при внутрикожном введении материала в разведениях 10-1-10-5 в четыре точки по 0,25 см3 по линиям перпендикулярно позвоночнику (каждое следующее разведение — на расстоянии 5-6 см от предыдущего). Об инфекционной активности вируса в суспензии судили по наличию кожных поражений на 1420-е сут на месте введения материала. При визуальном осмотре учитывали наличие припухлостей.

Для оценки патогенности вируса нодулярного дерматита для овец экспериментально заражали 4 ягнят романовской породы 1,5-месячного возраста (живая масса 7-8 кг), вводя 1,0 см3 вирусосодержащей 10 % суспензии биоптата внутривенно в яремную вену и внутрикожно в четыре точки в подмышечную область по 0,25 см3. Перед заражением контрольный ягненок был отсажен в отдельный вольер и привит физиологическим раствором внутривенно в яремную вену и внутрикожно в четыре точки в подмышечную область. Ежедневно проводили клинический осмотр животных, через каждые 3 сут отбирали пробы крови и делали смывы со слизистой носовой полости для исследования образцов на наличие вирусного генома.

Положительные пробы крови инфицированных ягнят использовали для выделения вируса в перевиваемой культуре клеток почки овцы (ПО ВНИИВВиМ) согласно протоколу World Organization for Animal Health (Международное эпизоотическое бюро, Париж, OIE — МЭБ) (29-31). Инфекционную активность вируса в пробах определяли титрованием в культуре клеток почки овцы в 48-луночных культуральных планшетах фирмы «Corning-Costar» (США) в среде Игла МЕМ (ООО «Биолот», Россия). Титр вируса рассчитывали по Керберу.

После эвтаназии с использованием препарата для бескровного умерщвления животных (Адилин-супер, «Федеральный центр токсикологической, радиационной и биологической безопасности», г. Казань) согласно инструкции по применению отбирали образцы тканей печени, подколенного лимфатического узла, легких и селезенки для исследования на наличие вирусного генома.

Эксперименты с животными проводились в соответствии с разрешением ФАНО России (¹ 33-11-0132/16.06.2016) под наблюдением Комиссии по биоэтике ФГБНУ ФИЦВиМ.

При расчете титров вируса определяли средние ( M ) и стандартные ошибки средних (±SEM).

Результаты. Возбудитель, вызвавший у коров в 2015 году в Республике Северная Осетия—Алания болезнь с клиническими признаками нодулярного дерматита, был идентифицирован секвенированием гена белка GPCR (G-protein-coupled chemokine receptor) — гомолога хемокиновых рецепторов, сопряженных с G-белком. Этот ген определяет спектр хозяев и может быть использован для дифференциации каприпоксвирусов (28). Филогенетический анализ, проведенный посредством сравнения полученной последовательности (депонирована в базе данных GenBank под номером KY595106) с опубликованными в GenBank полноразмерными нуклео- тидными последовательностями гена GPCR у различных штаммов и изоля-тов вируса нодулярного дерматита, позволил идентифицировать выделенный изолят как вирус нодулярного дерматита (рис. 1).

AF409137 LSDV isolate Neethling Warmbaths LW ♦ KY 595106 LSDV isolate RNOA-15

AF325528 LSDV isolate Neelhling 2490

FJ869352 LSDV Burkina Banfora isolate LSDV5

----FJ869 365 LSDV Niger Ibetecene isolate LSDV6 FJ869367 LSDV Sudan/99 Atbara isolate LSDV10

FJ869368 LSDV vaccine Nigeria isolate LSDV8 — FJ869370 LSDV RSA/06 Cow t6 isolate LSDV11

FJ869372 LSDV RSA/08 M143/08 10/6/08 isolate LSDV13

FJ869373 LSDV RSA/0 7 Brahman isolate LSDV14

— FJ869374 LSDV RSA/00 OP126402 isolate LSDV15

4l

FJ869377 LSDV Egypt/89

KJ462779 LSDV isolate LSD/Sivas/01WTUR

KJ818282 LSDV isolate Kenyavac (KSGP 0-240) — KP663691 LSDV isolate Adama/B02/2011

KP663695 LSDV isolate Andassa/B05/2012

KP663702 LSDV isolate El AR Debre zeiVB01/20Q9

KP663703 LSDV isolate FairFieM Debre zeit/B01/2009

KP663704 LSDV isolate Kajima Debre zeit/B01/2009

KP663706 LSDV isolate Mojo/B01/2011

KP663708 LSDV isolate NWCaPV Vaccine (KS-1)

— KP663710 LSDV isolate Wenji/B01/2011

KP719918 LSDV isolate LSDV35

— KR024778 LSDV isolate LSDV TUR KEY/2014-34

KR024780 LSDV isolate LSDV TUR KEY/2015-02

KP663694 LSDV isolate Andassa/B04/2012

-----------------------KP071937 LSDV isolate Egy

- FJ869369 LSDV Sudan/06 Obied isolate LSDV9

I FJ869376 LSDV RSA/54 Haden isolate LSDV17 ^(^ I AF409138 LSDV isolate Neethling vaccine LW 1959 ----------------AY077834 Sheeppoxvirus NISKHI

Рис. 1. Филогенетический анализ выделенного изолята вируса нодулярного дерматита на основе последовательности гена GPCR. В качестве внешней группы сравнения при построении дерева использовали нуклеотидную последовательность гена GPCR штамма НИСХИ вируса оспы овец. Исследуемый изолят отмечен ромбом. Длина ветвей дерева масштабирована в количествах нуклеотидных замен на последовательность.

В предварительном тесте на телятах вирусосодержащая суспензия биоп-тата вплоть до разведения 10-4 вызывала на 20-е сут появление узелков на коже в местах введения. С учетом вводимого объема материала (0,25 см3) титр вируса составил 105,1 ИД50/см3.

Рис. 2. Нодулы на коже ягненка в месте введения суспензии биоптата, содержащего вирус нодулярного дерматита крупного рогатого скота (13-е сут после экспериментального заражения; биоптат получен в 2015 году в Республике Северная Осетия—Алания).

В опыте по экспериментальному инфицированию ягнят (с учетом титра вируса в суспензии биоптата) суммарная доза вируса, введенного ягнятам внутривенно и внутрикожно, составила 105,4 ИД50. С 10-13-х сут после заражения у ягнят наблюдали появление нодул в местах введения вируса (рис. 2). Нодулы имели вид уплотнений кожи, диаметр которых постепенно увеличивался в течение 7 сут с 2 до 5 см. Со 2-й нед после заражения происходило заживление нодул и образование струпьев на пораженной коже. На 3-ю нед наблюдали полное заживление кожных поражений. Температурная реакция у всех зараженных ягнят в

течение 25 сут наблюдения оставалась в пределах нормы (температура составляла 38,8-40,5 ° С).

Для оценки тяжести клинических признаков нодулярного дерматита у ягнят использовали 10-балльную шкалу, предложенную V.M. Carn с соавт. (10), в которой 0 баллов — отсутствие видимых реакций, 1 балл — преходящая местная реакция, 2 балла — местные реакции умеренной тяжести (нодулы меньше 5 см в диаметре), отсутствует лимфаденопатия, 3 балла — местные реакции умеренной тяжести (нодулы меньше 6 см в диаметре), лимфаденопатия средней тяжести (10 баллов — тяжелая генера- лизация, требующая убоя, многочисленные вторичные нодулы диаметром 0,5-5,0 см, характеризующиеся отечностью, гиперемией и болезненностью, тяжелая лимфаденопатия, конъюнктивиты, риниты, вялость, потеря аппетита). По этой шкале тяжесть клинических признаков болезни у ягнят, инфицированных ВНД, выделенным от КРС, соответствовала 2 баллам, что свидетельствует о низкой патогенности этого вируса для овец. У контрольного ягненка видимых изменений на поверхности кожи не обнаружили. Температура тела оставалась в пределах нормы и составляла 38,539,0 °С в течении всего периода наблюдения.

На 15-е сут после заражения ягненок ¹ 2 был подвергнут эвтаназии для аутопсии внутренних органов. При вскрытии у него не обнаружили патологических изменений во внутренних органах, характерных для нодулярного дерматита КРС. В образцах ткани печени, подколенного лимфатического узла, легких и селезенки методом ПЦР-РВ геном вируса нодулярного дерматита выявили только в легких (Ct = 36,48) и лимфоузле (Ct = 32,94), тогда как в печени и селезенке его не обнаружили.

В крови инфицированных ягнят геном вируса нодулярного дерматита выявляли методом ПЦР-РВ на 9-17-е сут после экспериментального заражения, в смывах со слизистой полости рта — на 20-27-е сут (табл. 1). У контрольного ягненка геном вируса нодулярного дерматита в смывах с ротовой полости и пробах крови не обнаружили.

• 1.    Результаты ПЦР в реальном времени (значения Ct) при выявлении генома вируса нодулярного дерматита крупного рогатого скота у ягнят в пробах крови и смывах с ротовой полости при экспериментальном заражении

  Время после	Ягненок ¹ 1	Ягненок ¹ 2	Ягненок ¹ 3	Ягненок ¹ 4
  заражения, сут	кровь смывы	кровь смывы	кровь   смывы	кровь смывы

  3-и		–	–      –       –       –
  6-е		–	–      –       –       –
  9-е		–	–        –         –       37,45
  13-е		–	–        –         –       36,23
  15-е	35,99		—       — -	-
  17-е	38,38		39,08         –        37,23	-
  20-е		36, 65	_       _       _	35,71
  23-и		35,51	_       _       _	36,43
  27-е		38,34	_       _       _	33,19
  29-е			_       _       _
  Примеч	а н и е. Биоптат	получен в 2015	году в Республике Северная Осетия—Алания. Ct	— номер
  цикла, на	котором кривая	флуоресценции	пересекает пороговую линию; положительными	считаются

2.    Выделение вируса нодулярного дерматита из проб крови экспериментально инфицированных ягнят в культуре клеток почки овцы ПО ВНИИВВиМ

образцы, для которых значения Ct < 40 ; «—» — значения Ct отсутствуют, образец отрицательный. Ягненок ¹ 2 был выведен из эксперимента на 15-е сут эвтаназией для патологоанатомического исследования внутренних органов на наличие генома вируса нодулярного дерматита.

Время после заражения, сут	Титр вируса, lg ТЦД 50 /см3
	контроль	ягненок ¹ 1	ягненок ¹ 3	ягненок ¹ 4
3-и	н/и	н/и	н/и	н/и
6-е	н/и	н/и	н/и	н/и
9-е	-	-	-	-
13-е	-	-	-	-
15-е	-	1,0±0,12 (+)	-	1,5±0,14 (+)
17-е	-	1,5±0,24 (+)	1,6±0,15 (+)	1,7±0,18 (+)
20-е	-	-	-	-
23-и	-	-	-	-
27-и	н/и	н/и	н/и	н/и
29-и	н/и	н/и	н/и	н/и

Примечание. н/и — не исследовали; « - » — вирус не выделен (не наблюдали цитопатического действия вируса на протяжении 5 последовательных пассажей); «+» — наличие специфического цитопатиче-ского действия вируса на 2-м пассаже.

Для подтверждения виремии провели выделение вируса из проб крови, отобранных от всех ягнят с 9-х по 23-и сут после заражения, в перевиваемой культуре клеток почки овцы. Отметим, что цитопатическое действие, специфическое для вируса нодулярного дерматита, наблюдали только на 2-м пассаже на 5-7-е сут после заражения культуры (титр вируса составил 1,5-1,7 lg ТЦД50/см3) (табл. 2).

Проведенные исследования подтвердили имеющиеся в литературе данные о патогенности вируса нодулярного дерматита для овец при экспериментальном заражении (25).

Таким образом, полевой изолят вируса нодулярного дерматита, выделенный от крупного рогатого скота в Республике Северная Осетия— Алания в 2015 году, при подкожном и внутривенном инфицировании вызывал у ягнят появление кожных узелков только в местах введения вируса, что соответствует 2 баллам по 10-балльной шкале оценки тяжести клинических признаков нодулярного дерматита. Исследование методом ПЦР в реальном времени показало наличие генома вируса нодулярного дерматита в пробах крови и смывах с ротовой полости экспериментально инфицированных ягнят, а также в пробах легких и подколенного лимфоузла от подвергнутого эвтаназии ягненка. Выделение в культуре клеток вируса из положительных в ПЦР проб крови подтвердило присутствие инфекционного агента. В связи с этим допустимо предположить, что овцы могут служить источником вируса нодулярного дерматита, передающегося трансмиссивно. Для окончательного ответа на вопрос о возможности передачи вируса нодулярного дерматита овцами в естественных условиях необходимы дополнительные исследования, в том числе изучение роли переносчиков.