Влияние 11-дезоксимизопростола при курсовом введении на свободнорадикальное окисление в печени

Простагландины (ПГ) - производные эссенциальных жирных кислот, обладающие широчайшим спектром активности. Разработка и внедрение в практику синтетических аналогов ПГ является актуальной проблемой, а потребность в лекарственных средствах, содержащих простагландиновый фрагмент и обладающих доказанным терапевтическим эффектом, оказывающих минимум побочных действий, постоянно растет, что значительно расширяет области их применения [9].

Ранее были продемонстрированы антира-дикальное и антиоксидантное действие этилового эфира (±)-11,15-дидезокси-16-метил-16-гидроксипростагландина E1  11-дезоксими-зо- простола (ДМП) [3, 5]. Но, невзирая на отчётливую активность в условиях модельных систем in vitro, не представляется возможным однозначное заключение о направленности и выраженности эффектов 11-ДМП как модулятора свободнорадикальных процессов in vivo. Конкретизация механизмов действия изучаемого вещества на про- и антиоксидантные системы, возможные ткане- и органоспецифичные особенности, зависимость «доза - эффект» на уровне органов и организма, а также весьма вероятные для 11-ДМП свойства непрямого модулятора про- и антиоксидантных систем, могут быть установлены только в условиях отдельной серии экспериментов in vivo.

Учитывая относительно высокую тропность 11-ДМП к печени [4], возможность существенных различий в эффектах про- или антиоксиданта в зависимости от условий его применения [8], считаем целесообразным экспериментальное исследование, предусматривающее моделирование курсового применения 11-ДМП в нескольких дозах c регистрацией его про- и антиоксидантных эффектов.

ЦЕЛЬ РАБОТЫ

Установить закономерности про- и антиоксидантных эффектов 11-ДМП в печени при его курсовом введении в различных дозах.

МЕТОДИКА ИССЛЕДОВАНИЯ

Исследуемое соединение (этиловый эфир (±)-11,15-дидезокси-16-метил-16-гидроксипрос-тагландина E1, 11-ДМП) было синтезировано ипредоставлено лабораторией синтеза низкомолекулярных биорегуляторов ФГБУН УфИХ РАН, г. Уфа.

Экспериментальные исследования спланированы и проведены на 120 белых лабораторных крысах. С целью интегральной оценки про- и антиоксидантных эффектов 11-ДМП in vivo при его ежедневном внутрижелудочном введении сформировано 12 экспериментальных групп лабораторных крыс - самцов (n = 10): из них 3 группы животных получали масляный раствор 11-ДМП в дозах 0,5, 1,0 и 2,0 мг/кг в течение суток, 3 экспериментальные группы получали 11-ДМП в течение 3 суток ежедневно, и 3 - в течение 7 суток. Еще 3 контрольные группы животных получали внутрижелудочно эквиобъемное количество растворителя в той же кратности, что и каждая из опытных групп. Животных умерщвляли через 24 часа после завершения введения 11-ДМП и производили взятие биологического материала для исследований. В гомогенатах печени определяли первичные, вторичные [2], и конечные [6] продукты липопероксидации, окислительной модификации (карбонилирования) белков (ОМБ) [7], активность ферментов антиоксидантной системы: глутатионпероксидазы, супероксиддисмутазы и каталазы [1]. В работе использовали супернатант, полученный после центрифугирования (4000 об./мин, 20 минут, 4 °С) гомогенатов печени, приготовленных на 0,1 М Na-фосфатном буфере (рН 7,4).

Первичные и вторичные, а также конечные продукты перекисного окисления липидов (ПОЛ) количественно определяли методом электронной спектрофотометрии в ультрафиолетовой (УФ) области после получения соответствующих экстактов.

В результате переокисления полиненасы-щенных жирных кислот (ПНЖК) происходит трансформация двойных связей ацилов в диеновые коньюгаты (первичные продукты), что подтверждается появлением максимума поглощения в УФ-спектрах при 230-238 нм. Полученные результаты в сравнении с контрольными образцами позволяли оценить содержание гидроперекисей в липидном экстракте. Характерным подтверждением деструкции липидных гидроперекисей также является присутствие в УФ-спектре поглощения дополнительного максимума при 260–290 нм. Дополнительно регистрировали оптическую плотность экстрактов при (400 ± 2) нм, отражающую уровни оснований Шиффа (конечные продукты ПОЛ) [6]. Для получения исследуемых образцов в качестве экстрагента применяли смесь изопропилового спирта и гептана. Липидную вытяжку разделяли на фазы добавлением воды, очищенной в зависимости от полярности. Основное количество фосфолипидов сосредотачивается в водноспиртовой фазе, а большая часть триацилгли-церидов содержится в гептановой фазе [2]. Определение оптической плотности и запись спектров поглощения исследуемых экстрактов осуществляли на спектрофотометре СФ-56 (ОКБ «Спектр», Россия).

По установленным значениям оптических плотностей рассчитывали индексы окисления, как отношение оптических плотностей при определенных длинах волн - Е232/Е220 и Е278/Е220. Первичные и вторичные, а также конечные продукты ПОЛ и их относительный уровень оценивали по соответствующим значениям индексов окисления.

Содержания карбонильных продуктов окислительной модификации белков производили методом электронной спектрофотометрии в УФ области. Метод основан на спектрофотометрическом определении динитрофенилгид-разонов (ДНФГ), продуктов взаимодействия белков в результате их реакции с 2,4-динит-рофенилгидразином (2,4-ДНФГ). В полученных спектрах поглощения ДНФГ анализировали значение площади под кривой и устанавливали содержание дериватов карбонильных производных белков [7]. Применение данного методического подхода позволило определить содержание ке-тонных, альдегидных продуктов нейтрального и основного характера, общий уровень ОМБ, сопоставить значения первичных и вторичных маркеров ОМБ, и по полученным данным сделать предварительный вывод об основных путях нарушения нативной конформации белков.

Регистрацию карбонильных производных осуществляли параллельно в двух вариантах: оценка спонтанной ОМБ: реакция с 2,4-динитро-фенилгидразином в нативной пробе исследуемого материала, и оценка металл-катализи-руемой (металл-зависимой, индуцированной) окислительной модификации белков, осуществляемой после предварительно in vitro -индукции окисления белков исследуемого материала компонентами реакционной смеси, содержащей приготовленные ex tempore растворы FeSO4, пероксида водорода и этилендиа-минтетрауксусной кислоты (ЭДТА). Результат выражался в ЕД/г белка. Концентрацию белка в исследуемых экстрактах определяли микробиуретовым методом. Определение оптической плотности и запись спектров поглощения исследуемых экстрактов осуществляли на спектрофотометре СФ-56 (ОКБ «Спектр», Россия). На первом этапе проводили раздельную оценку спонтанной и металл-зависимой ОМБ. На втором этапе осуществляли расчет отношений результатов измерений продуктов спонтанного окисления к индуцированному в соответствии с реакцией Фентона, при этом результат измерения индуцированного окисления принимали за 100 %. Полученные данные позволили охарактеризовать резервно-адаптационный потенциал (РАП) исследуемой ткани [7], и дать интегральную оценку мощности антиоксидантных систем исследуемой ткани.

Об активности глутатионпероксидазы (ГП) судили по количеству израсходованного в ходе реакции глутатиона, которое детектировали с помощью реактива Эллмана [5,5-дитиобис (2-нитро-бензойной кислоты)]. В качестве субстрата в реакции использовали гидроперекись третбутила [1]. Определение оптической плотности и запись спектров поглощения исследуемых экстрактов осуществляли на спектрофотометре СФ-56 (ОКБ «Спектр», Россия).

Результаты активности супероксиддисмутазы (СОД) в исследуемых экстрактах устанавливали путем фиксации кинетики подавления накопления адренохрома в окислительно-восстановительной системе адреналин-адренохром. В УФ-спектрах поглощения при длине волны (480 ± 2) нм определяли адренохром, образующегося из адреналина в щелочной среде. Фотометрическую детекцию осуществляли с использованием анализатора биожидкостей «Флюорат-02-АБЛФТ» (НПО «Люмекс», Россия).

Для исследования использовали супернатант, полученный после центрифугирования (4000 об./мин, 20 минут, 4 °С) гомогенатов тканей, приготовленных на 0,1 М Na-фосфатном буфере (рН 7,4). Активность фермента рассчитывали с учетом разведения исследуемого образца биологического материала, соотнося с содержанием белка в пробе, и выражали в Ед/с^1 мг белка [1].

Определение активности каталазы в биологическом материале производили методом электронной спектрофотометрии в УФ области. Метод основан на образовании устойчивого окрашенного комплекса пероксида водорода с солями молибдена. На спектрофотометре

СФ-56 (ОКБ «Спектр», Россия) осуществляли запись и регистрацию спектров образовавшегося комплекса при длине волны (410 ± 2) нм. Раствор молибдата аммония, добавленный до первой инкубации, служил контролем. Расчет удельной активность фермента осуществляли с учетом разведения образца исследуемого материала, соотнося с содержанием белка в пробе, и выражали в Ед/с·1 мг белка.

С помощью программных пакетов MS Excel 2010 и Statistica 10 for Windows осуществляли статистическую обработку полученных данных. Полученные результаты представлены в виде медианы и величин 25 и 75 перцентилей. Выявление достоверных различий между группами данных осуществляли с использованием U теста Манн – Уитни.

С целью определения статистической взаимосвязи между изучаемыми параметрами был проведен корреляционный анализ с расчетом коэффициента корреляции Спирмена (Rs). Различия считали статистически значимыми при уровне p < 0,05.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯИ ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

При введении 11-ДМП в исследуемых дозах в печени наблюдали транзиторное усиление ПОЛ на первые и третьи сутки курсового введения (см. табл.).

Влияние 11-ДМП на содержание продуктов перекисного окисления липидов, окислительной модификации белка, активность антиоксидантых ферментов в печени при внутрижелудочном введении [Me (LQ; UQ)]

Показатель	Группа (кратность введения, дозы)
	Контроль	0,5 мг/кг	1,0 мг/кг	2,0 мг/кг
Уровни продуктов перекисного окисления липидов
1-кратное введение
ДК [И], е.и.о.	0,709 [0,693; 0,731]	0,769 [0,729; 0,829]	0,903* [0,844; 0,965]	0,981* [0,945; 1,033]
3-кратное введение
КДиСТ [Г], е.и.о.	0,474 [0,41; 0,615]	0,511 [0,492; 0,587]	0,572 [0,54; 0,626]	0,714* [0,62; 0,816]
ДК [И], е.и.о.	0,779 [0,761; 0,803]	0,801 [0,752; 0,864]	0,907* [0,887; 0,953]	0,973* [0,937; 1,024]
Окислительная модификация белков (ОМБ)
1-кратное введение
S общ. (МКО), ЕД/г белка	110,588 [97,066; 123,994]	109,021 [90,794; 121,55]	140,629* [114,133; 225,8]	134,634* [124,13; 153,236]
РАП, %	56,467 [53,959; 60,268]	58,878 [35,035; 65,645]	75,194* [63,407; 82,818]	77,473* [71,067; 79,428]
7-кратное введение
S общ. (МКО), ЕД/г белка	83,696 [72,572; 90,681]	90,835 [74,889; 99,53]	115,004* [76,763; 165,38]	115,457* [109,447; 134,06]
РАП, %	53,774 [52,263; 57,38]	49,08 [24,384; 60,67]	67,644 [49,111;70,097]	73,394* [65,855; 75,9]
Ферменты антиоксидантной защиты
3-кратное введение
СОД, Ед/с·1 мг белка	50,93 [44,317; 54,268]	46,89 [38,997; 79,754]	93,22* [83,256; 99,491]	53,001 [6,692; 60,216]
7-кратное введение
ГП, нмоль/мин·1 мг белка	1232,62 [1104,1; 1331,9]	1279,13 [1219,92; 1406,3]	1811,7* [1447,6; 2164,1]	1552,04* [1442,3; 1667,8]

Примечание: в табл. представлены статистически значимые изменения [И] - изопропанольная фаза; [Г] - гептановая фаза; е.и.о. - единицы окислительного индекса; КДиСТ - кетодиены и сопряженные триены; ДК - диеновые конъюгаты; З общ. - общий уровень ОМБ; РАП - резервно-адаптационный потенциал; МКО - металл-катализируемое окисление; СОД - супероксиддисмутаза; ГП - глутатионпероксидаза; * - статистически значимые отличия от соответствующего показателя контрольной группы.

При введении 11-ДМП в течение семи суток уровень продуктов ПОЛ статистически значимо не отличался от соответствующих значений контрольной группы. На первые и седьмые сутки курсового введения 11-ДМП в дозах 1,0 и 2,0 мг/кг было выявлено умеренное усиление металл-катализируемой при неизменном базальном уровне ОМБ (см. табл.).

Такие изменения закономерно сопровождались увеличением резервно-адаптационного потенциала (РАП). Не исключено, что развитие окислительного стресса в этих условиях сдерживается благодаря активации ферментативных антиоксидантных систем. При исследовании активности антиоксидантных ферментов в гомогенатах печени на третьи сутки введения 11-ДМП в дозе 1,0 мг/кг выявлен прирост активности супероксиддисмутазы (также следует учесть прямую дисмутазную активность 11-ДМП, продемонстрированную ранее) [3], и глутатионпероксидазы – на седьмые сутки курсового введения.

В результате проведенного исследования, можно определить оптимальные дозы и режимы введения 11-ДМП, позволяющие выявить его антиоксидантные эффекты in vivo . Учитывая, что уровень ДК отражает активность этапов инициации ПОЛ под действием свободных радикалов, можно предположить, что усиление диеновой конъюгации ацильных радикалов липидов на ранних сроках курсового введения исследуемого соединения отражает повышение активности систем биотрансформации ксенобиотиков в печени. Здесь также следует учесть и результаты фармакокинетических исследований, продемонстрировавших высокую гепато-тропность 11-ДМП [4].

Представляется важным, что при введении 11-ДМП в дозе 1,0 мг/кг остается неизменным уровень ОМБ, не фиксируется значимый прирост уровней вторичных и конечных продуктов ПОЛ, что свидетельствует об адекватной реакции со стороны систем антиоксидантной защиты, ограничивающих ОМБ на ранних этапах и прерывающих ПОЛ на этапе инициации. Также обращает на себя внимание прямая зависимость интенсивности диеновой конъюгации липидов и ОМБ в печени от дозы 11-ДМП.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

При курсовом введении 11-ДМП наблюдается усиление свободнорадикальных процессов в печени. Снижение показателей окисления липидов и белков к седьмым суткам до уровня контрольной группы сопряжено с активацией антиоксидантных систем на третьи и седьмые сутки курсового введения 11-ДМП.

RIORYAZGMU. 2014. 60 p. (In Russ.).