Влияние амилорида на активность NA + /H +-обменника тромбоцитов

Интенсивная терапия ишемической болезни сердца остается актуальной задачей современной кардиологии [5, 6, 7, 8, 10]. Однако применение в последние годы активных терапевтических и хирургических методов лечения способствовало возникновению новой серьезной проблемы — развитию постишемического реперфузионного синдрома, который приводит к увеличению тяжести и зоны повреждения и, как следствие, нарушению сократимости, развитию аритмий, острой сердечной недостаточности [3, 5, 6, 11].

Основные принципы современной кардиопротекции направлены на сохранение коронарного кровотока, замедление ремоделирования камер сердца, повышение толерантности к повреждающему действию различных экзо- и эндогенных факторов [4, 6—8, 10, 11].

Среди выдвигаемых новых подходов перспективным выглядит использование соединений, способствующих развитию так называемого «ишемического прекондиционирования» (ischemic preconditioning), своеобразной тренировки сердечной мышцы, повышающей ее адаптацию к ишемии и реперфузии [3]. Одной из таких групп являются ингибиторы Na+/H+-обменника изоформы 1 (NHE-1). Эта изоформа локализуется преимущественно в плазматической мембране миокарда, тромбоцитах и эритроцитах [3, 12, 13, 15] и вовлечена в регулирование внутриклеточного pH во время ишемии/ реперфузии. Однако чрезмерное стимулирование NHE-1 способствует увеличению содержания внутриклеточного Ca++, что приводит к аритмиям и «оглушению» миокарда и дальнейшему некрозу [3, 12]. Кардиопро- текторное действие ингибиторов NHE-1 связано с уменьшением повреждающего действия чрезмерной активации данного обменника [3, 12, 13]. Одним из его первых известных ингибиторов является амилорид. В литературе встречаются неоднозначные данные об его активности в отношении NHE-1, а также его токсичности [3, 14]. Поэтому мы посчитали необходимым изучить NHE-1-ингибирующую активность препарата на тромбоцитах кролика, летальную дозу при внутрибрюшинном введении, а также рассчитать терапевтический индекс.

ЦЕЛЬ РАБОТЫ

Изучение влияния амилорида на активность NHE-1 тромбоцитов кролика и острой токсичности.

МЕТОДИКА ИССЛЕДОВАНИЯ

Для изучения влияния амилорида на активность Na+/H+-обменника была использована методика на тромбоцитах кролика, описанная Rosskopf D., et al. (1991) и Kusumoto K. (2002) [2, 15, 13]. Образцы крови забирали из краевой вены уха кролика в пробирку, содержащую 3,8 % цитрата натрия, в соотношении 1 : 10. Каждый образец центрифугировали с числом 1000 об./мин в течение 12 мин. Собирали надосадочную часть — плазму, богатую тромбоцитами (ПБогТ). Активацию NHE-1 проводили раствором пропионата натрия (600 мкл, в ммоль/л: Na пропионат 135, HEPES 20, СaCI2 1, МgCI2 1, глюкоза 10; pH 6.7; t = 37 оС). Для контроля изменения светопропускания в условиях нормальной рН использовали раствор Кребса (600 мкл, в ммоль/л: NaCl — 120, KCl — 4,8, KH2PO4 — 1,2, MgSO4 — 2,5, NaHCO3 — 25, CaCl2 — 2,6, глюкоза — 5,4; pH 7,4; t = 37 оС).

Амилорид (10 мкл) добавляли в кювету с ПБогТ (200 мкл) и инкубировали 3—5 минут при температуре 37 оС, постоянном перемешивании с помощью магнитной мешалки (1000 об. в мин). Исследования проводились в диапазоне концентраций 10-7—10-5 М/л.

Изменения формы тромбоцитов регистрировали по изменению светопропускания [13, 15] с помощью лазерного агрегометра «БИОЛА-220 ЛА», Россия.

Рассчитывали IC50-концентрацию соединения, при которой NHE ингибирующая активность составляет 50 %. Величину IC50 амилорида определяли с помощью регрессионного анализа зависимости между lg концентрации и активностью обменника Excel 2007 (MS Office XP, США).

Изучение острой токсичности амилорида проводили на 30 половозрелых мышах-самцах массой 20—30 мг/кг. Вещество вводили животным внутрибрюшинно в дозах 10, 20, 30, 40, 50 мг/кг.

Общая продолжительность наблюдения за животными составляла 14 дней. Первые сутки мыши находились под непрерывным наблюдением. У них отмечали общее состояние, особенности их поведения, интенсивность и характер двигательной активности, наличие и характер судорог, реакцию на тактильные, болевые, звуковые и световые раздражители и сроки гибели. Последующие 2 недели наблюдали за выживаемостью животных.

Расчет LD50 (мг/кг) производили с использованием пробит-анализа [9], реализованного в программе Excel 2007 (MS Office XP, США).

Терапевтический индекс рассчитывали с использованием известной формулы с учетом IC50 и LD50 амилорида.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯИ ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

При добавлении раствора пропионата натрия к ПБогТ происходит увеличение притока натрия, связанное с выделением цитозольного H+, посредством Na+/H+-обменника, ведущее к отеку тромбоцитов в результате аккумуляции воды в цитоплазме [13, 15]. При этом наблюдается облегчение светопропускания.

В контрольной серии экспериментов при добавлении к ПБогТ натрийпропионатного буфера происходил значительный рост светопропускания по сравнению с добавлением раствора Кребса (рис. 1).

Обозначения: 1 — контроль с раствором Кребса; 2 — контроль с натрия пропионатным буфером; 3 — опыт с амилоридом в дозе 1 х 10 -5 М/л; 4 — опыт с амилоридом в дозе 1 х 10 -6 М/л; 5 — опыт с амилоридом в дозе 1 х 10 '7 М/л.

Рис. 1. Кривые записи изменения светопропускания при введении в пробы различных доз амилорида (лазерный агрегометр «БИОЛА-220 ЛА», Россия)

В условиях предварительного добавления к ПБогТ амилорида изменение светопропускания было незначительным (рис. 1), что вероятно связано с блокадой NHE и отсутствием сферуляции тромбоцитов. Это согласуется с данными литературы [13, 15]. В ходе проведенного исследования было показано дозозависимое угнетение активности NHE-1 при использовании амилорида в диапазоне концентраций 10-7—10-5 М/л (рис. 1). Рассчитана величина IC50, которая составила 1,23*10-6 М/л (рис. 2).

При изучении острой токсичности амилорида при внутрибрюшинном введении мышам было показано, что в течение первого часа после введения соединения во всех экспериментальных группах изменений не отмечалось: сохранялась активная поисковая деятельность, тактильная и болевая чувствительность, отсутствовали судороги.

Рис. 2. Зависимость ингибирующего эффекта амилорида на Na+/H+-обменник от концентрации (расчет величины IC50)

Однако в течение суток у некоторых животных наблюдалось увеличение частоты дыхания, угнетение двигательной активности и координации в движениях, снижение тонуса скелетных мышц, отсутствие реакций на тактильные, болевые, звуковые и световые раздражители, появление судорог, смерть животных.

По результатам исследования гибель животных наблюдалась, начиная с дозы 20 мг/кг. С увеличением вводимой дозы амилорида количество погибших животных возрастало.

Для расчета LD50 процент гибели был переведен в пробит-баллы с помощью специальных таблиц [9], и рассчитан логарифм концентраций (рис. 3).

Рис. 3. Дозовая зависимость гибели в координатах «lg дозы-пробит» при изучении острой токсичности амилорида

Рассчитана величина LD50 для одних суток, которая для препарата амилорида при внутрибрюшинном введении составила 35 мг/кг. В период двухнедельного наблюдения дополнительной гибели животных не было. Учитывая классификацию токсичности химических веществ при парентеральном способе введения по Березовской [1], амилорид можно отнести к умеренно токсичным.

Был рассчитан терапевтический индекс, который составил 106,1 условных единиц.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Амилорид оказывает дозозависимое ингибирующее действие на активность NHE-1 тромбоцитов кролика. IC50 составила 1,23*10-6 М/л. Полученные данные сопоставимы с литературными данными (база данных EMBL-EBI, 2010). Ами-лорид относится к умеренно токсичным соединениям, летальная доза составляет 35 мг/кг. Терапевтический индекс амилорида — 106,1 условных единиц.