Влияние бактерии Salinicola socius SMB35T на рост озимого рапса при низкой положи-тельной температуре

Успешная перезимовка озимого рапса напрямую связана с достижением растениями оптимального физиологического состояния до наступления зимы [Горлов, Бушнев, Асхадуллин, 2009; Бородько, 2020; Пилюк, 2020; Ториков и др., 2022; Фетюхин, Ахмадов, Алиев, 2023]. Ключевую роль в помощи растениям для преодоления абиотических стрессов, в том числе холода, играют ризосферные бактерии, стимулирующие рост растений (PGPB – Plant Growth-Promoting Bacteria). Большинство этих бактерий обладают способностью улучшать характеристики роста и урожайность в естественных условиях, осуществляя азотфиксацию, синтезируя фитогормоны, а также увеличивая доступность питательных веществ у многих растений, проводя дезаминирование молекулы-предшественника фитогормона этилена, накопление которого в корневой ткани, как известно, вредно для роста и развития корней [Glick, Penrose, Jiping, 1998; Максимов и др., 2015], индуцируя системную устойчивость растений к патогенным микроорганизмам [Lavania et al., 2006] и антагонизм по отношению к вредным микроорганизмам [Singh et al., 2010; ALKahtani et al., 2020]. В связи с этим обработка семенного материала перед посевом биологическими препаратами является перспективным приемом повышения устойчивости растений озимых культур к неблагоприятным условиям зимнего периода [Горьков, 2019; Березнов, Астарханова, Шаповал, 2022; Старцева, Акманаев, Майсак, 2024].

Одними из представителей группы PGPB являются бактерии рода Salinicola. В наземных биотопах бактерии рода Salinicola являются типичными компонентами микробиомов галофитов и населяют в том числе ткани надземных и подземных органов растений. Представители этого рода влияют на рост и развитие растений, разрушая токсичные органические соединения, увеличивая доступность минеральных компонентов, модулируя выработку или деградацию фитогормонов, а также подавляя патогены или поставляя растениям органические соединения, способствующие солеустойчивости [Plotnikova et al., 2020].

Цель исследования – оценить влияние бактерии Salinicola socius SMB35^T на ростовые показатели озимого рапса в опытах in vitro .

Материалы и методы исследования

Объект исследования . В работе использовали штамм S. socius SMB35^T. В качестве тестового объекта выбрали озимый рапс ( Brassica napus L.) сорта ‘Северянин’ категории «первая репродукция» (РС1). Семена рапса предоставлены Пермским НИИСХ.

Среды и условия культивирования бактерии. Штамм бактерии хранили на плотной богатой питательной среде Раймонда [Plotnikova et al., 2011], содержащей хлорид натрия в концентрации 3%. Дальнейшие эксперименты проводили с использованием жидкой минеральной среды Раймонда (МСР) [Plotnikova et al., 2011]. В МСР добавляли хлорид натрия до концентрации 5%. Источником углерода и энергии в МСР служила глюкоза в конечной концентрации 1 г/л. Культивирование проводили в течение 24 ч при 25ºС на роторной качалке со скоростью вращения 100 об/мин. Далее биомассу собирали, центрифу- гируя суспензию клеток при 10 000 х g в течение 10 мин в условиях комнатной температуры. Культуральную жидкость сливали.

Изучение роста бактерии в условиях низкой температуры . Культивирование бактерии осуществляли на агаризованной МСР [Plotnikova et al., 2011], содержащей 2% хлорида натрия и глюкозу в конечной концентрации 1 г/л. Инокулятом служила культура, выращенная до стационарной фазы в жидкой МСР с тем же количеством хлорида натрия и ростового субстрата. Биомассу на плотную питательную среду наносили штрихом микробиологической петлей. Рост при температуре 5^oC оценивали каждые седьмые сутки.

Детекция индол-3-уксусной кислоты . Штамм S. socius SMB35^T выращивали в 1% триптоновом бульоне как с добавлением триптофана (150 мг/л), так и без него. Предварительно среду разливали в колбы по 20 мл, автоклавировали при 0.5 АТМ в течение 30 мин. Затем вносили бактерию и инкубировали в течение 2 сут. Из полученной суспензии отбирали 1.5 мл и центрифугировали при 10 000 х g в течение 2 мин. Определение индол-3-уксусной кислоты (ИУК) проводили в 1.5 мл супернатанта согласно методике, описанной Glickmann, Dessaux [1995]. Пробирки инкубировали в темноте при комнатной температуре в течение 30 мин. Развитие розовой окраски свидетельствовало о присутствии ИУК. В качестве отрицательного контроля использовали среду без добавления бактерии.

Обработка семян рапса бактерией . Семена стерилизовали, сначала помещая на 15 мин в 3% раствор перекиси водорода, затем выдерживая в течение 15 мин в 1% растворе перманганата калия. На следующем этапе семена отмывали дистиллированной водой до получения прозрачного раствора. Как правило, инокуляцию семян проводят, выдерживая их в суспензии клеток бактерии. Однако концентрация хлорида натрия в среде культивирования бактерии является слишком высокой для растений. В связи с этим обработку осуществляли сырой биомассой бактерии. К 40 или 20 мг сырой биомассы бактерии добавляли 1 г стерилизованных семян озимого рапса. Выдерживали в течение 30 мин, периодически встряхивая для распределения бактерий по семенам.

Условия культивирования растений . Эксперименты проводили в чашках Петри. 25 семян рапса помещали на фильтровальную бумагу, предварительно увлажненную 5 мл дистиллированной воды. Инкубирование проводили в темноте при 25ºС или 5^oС. В ходе эксперимента дистиллированную воду добавляли порциями по 1 мл с разной периодичностью в зависимости от температуры: при 25°C – каждые третьи сутки, а при 5°C – каждые седьмые сутки. Всхожесть, высоту побегов и длину корней определяли на седьмые сутки культивирования. Сырую массу (СМ) проростков определяли через 14 дней. Для этого проростки промокали фильтровальной бумагой, затем взвешивали.

Подготовка экстрактов из проростков растений . Проростки, отобранные из одной чашки, промывали 3 раза дистиллированной водой, затем растирали с кварцевым песком. К полученной суспензии добавляли 80% раствор этанола. Экстракцию проводили в течение 2 ч на встряхивателе АВ 30-С (Россия) при комнатной температуре. Остатки клеток и кварцевый песок осаждали, центрифугируя при 10 000 х g в течение 3 мин. Раствор отбирали. Экстракт упаривали при температуре 45^oС.

Спектроскопия протонного магнитного резонанса . Определение осмолитов проводили с помощью спектроскопии протонного магнитного резонанса на приборе Bruker Avance Neo 400 (400 МГц). При записи спектров ЯМР ¹Н использовали 30-градусные импульсы, релаксационная задержка составляла 1 с, ширина спектрального окна была равна 5.9 кГц. Данные обрабатывали с помощью программного обеспечения Topspin, версия 4.0.8 (Bruker Corporation, США). Высушенный осадок этанольного экстракта растворяли в 0.50 мл D 2 O (ООО «Кемикал Лайн», Россия). Спектр предварительно записывали с 8 накоплениями, затем в пробу вносили внутренний стандарт, серную кислоту и записывали спектр с 64 накоплениями, который использовали для количественных расчетов. 0.7‒1.0 мг серной кислоты вносили с целью смещения химических сдвигов пролина в слабое поле, в область, свободную от сигналов других веществ. Химические сдвиги (δ) указывали в миллионных долях (м.д.) и измеряли относительно сигнала HDO (4.71 м.д.). В качестве внутреннего стандарта использовали малеиновую кислоту, после подкисления имеющую сигнал при 6.32‒6.35 м.д. Идентификацию сигналов в спектре проводили добавлением в исследуемые растворы коммерческих препаратов соответствующих соединений. Химические сдвиги пиков, использованных для интегрирования, составили 4.14 м.д. для пролина (α-CH, дублет дублетов) и 5.40 м.д. – для сахарозы (аномерный протон, дублет). Количества соединений рассчитывали путем сравнения площади пика соединения с площадью пика внутреннего стандарта [Nagata et al., 1996].

Поиск генов в геноме S. socius SMB35^T . Поиск генов, кодирующих ферменты синтеза ИУК, осуществляли в геноме S. socius SMB35^T, депонированном в Genbank под номером PRJNA357614.

Статистическая обработка результатов . Оценку статистической достоверности различий средних значений проводили с использованием t-критерия Стьюдента в Microsoft Office Excel 2003.

Результаты и их обсуждение

Штамм S. socius SMB35^T проверили на способность синтезировать ИУК. Для этого бактерию выращивали в 1% триптоновом бульоне с добавлением триптофана. Детекцию ИУК проводили, отбирая образцы клеточной суспензии через 5, 24 и 48 ч культивирования. Добавление реактива Сальковского спустя 5 ч культивирования не привело к изменению цвета культуральной жидкости. После внесения реактива Сальковского в суточную культуру было отмечено изменение цвета культуральной жидкости на розовый, это свидетельствовало о наличии в среде гетероауксина. Спустя 48 ч культивирования также фиксировали положительный результат после добавления реактива. Кроме того, изучена способность исследованного штамма синтезировать ауксин в 1%-ном триптоновом бульоне без дополнительного внесения триптофана. Спустя 48 ч инкубирования в культуральную жидкость добавили реактив Сальковско-го, что привело к развитию розового окрашивания раствора. Зависимость синтеза ИУК от фазы роста описана для представителей разных таксонов прокариот. У большинства из них, за исключением штаммов рода Pseudomonas , максимальное количество этого соединения было обнаружено в стационарной фазе роста [Мирзоева, Широких, 2010]. В геноме штамма S. socius SMB35^T осуществлен поиск генов, ассоциированных с синтезом ауксинов. В настоящей работе гены, продукты которых идентифицированы как ферменты синтеза гетероауксина, в геноме бактерии S. socius SMB35^T не выявлены. Представители многих видов рода Salinicola , например, S. halimionae, S. aestuarinus, S. endophyticus, S. halophyticus, S. lusitanus и S. salarius , в том числе штаммы вида S. socius , продуцируют гормон ИУК [Fidalgo et al., 2019; Lavanya, Deepika, Sridevi, 2023]. Однако, несмотря на это, конкретные метаболические пути, обеспечивающие выработку ИУК, как и гены, кодирующие ферменты его синтеза, у представителей этого рода до сих пор не описаны. Между тем, в геноме исследованного штамма присутствовал ген, продукт которого осуществляет экскрецию гетероауксина из клетки (GenBank №OLO06226), что также косвенно подтверждает способность бактерии синтезировать ИУК.

Влияние инокуляции семян бактерией S. socius SMB35^T на рост озимого рапса . В данной работе изучили влияние разного количества бактерии S. socius SMB35^T на морфометрические показатели проростков озимого рапса при оптимальной температуре, соответствующей 25^oС (табл. 1).

Таблица 1

Влияние инокуляции семян бактерией S. socius SMB35^T на рост озимого рапса при оптимальной температуре

[The effect of seed inoculation with S. socius SMB35^T on the growth of winter rapeseed at optimal temperature]

Вариант эксперимента	Параметр
	Высота стеблей, мм	Длина корней, мм	Мин-Макс высота стеблей, мм	Мин-Макс длина корней, мм

40 мг бактериальной биомассы/г семян

Контроль	29.4±10.0	44.2±35.9	3‒50	5‒120
Семена, обработанные бактерией	23.5±11.0*	37.9±31.8	3‒50	3‒110

20 мг бактериальной биомассы/г семян

Контроль	37.4±14.3	44.3±36.9	5‒75	2‒125
Семена, обработанные бактерией	40.2±13.9	48.9±38.8	15‒80	4‒135

Примечание: * –различия достоверны при р < 0.01. Три биологических повторности.

Для этого использовали 20 или 40 мг сырой бактериальной биомассы для обработки 1 г семян. Показано, что действие бактерии зависело от количества биомассы. Так, использование 40 мг биомассы значительно снижало высоту побегов, отмечен тренд к уменьшению длины корней (табл. 1). Помимо этого, значения минимальной и максимальной величин корней у проростков, выросших из инокулированных бактерией семян, были ниже, чем в контрольной группе (табл. 1), в то время как снижение количества биомассы бактерии до 20 мг в обработке семян нивелировало негативный эффект. Более того, хотя достоверно значимого различия высоты побегов и длины корней между проростками, выросшими из обработанных бактерией семян, и контролем не получено, очевидна тенденция на увеличение этих показателей в опытной группе (табл. 1). Кроме того, у инокулированных бактерией проростков наблюдалось возрастание минимальных и максимальных значений высоты побегов и длины корней по сравнению с контролем (табл. 1), что указывает на стимуляцию роста. Опираясь на полученные данные, в последующих экспериментах использовали 20 мг биомассы штамма S. socius SMB35^T.

Таким образом, характер действия бактерий на рост растений напрямую зависит от их концентрации. Оптимальные концентрации способствуют развитию растений, стимулируя, в частности, рост корней и побегов, вероятно, посредством синтеза фитогормонов. В то же время превышение концентрации может привести к гормональным нарушениям, вызывая угнетение корнеобразования, морфологические аномалии и гибель растений [Li et al., 2022; dos Santos et al., 2022; Васильев и др., 2025].

Влияние инокуляции семян бактерией S. socius SMB35^T на всхожесть и биомассу проростков озимого рапса при низкой положительной температуре . Инкубирование штамма S. socius SMB35^Т в течение длительного периода (мес.) позволило выявить его способность к росту при температуре 5°С. В конце третьей недели культивирования на плотной МСР штамм формировал в основании штриха множество мелких колоний диаметром менее 1 мм. В связи с тем, что исследованный штамм сохраняет физиологическую активность при низкой температуре, исследовали его влияние на рост озимого рапса в условиях холода. Семена озимого рапса обработали бактерией и культивировали в течение 2 недель в темноте при температуре 5^oС. В контрольной и опытной группах параметры всхожести семян отличались. Отмечено увеличение всхожести инокулированных бактерией семян на 13.3% (табл. 2). В конце эксперимента оценка сырой биомассы проростков показала ее возрастание на 15.1% в опытной группе.

Таблица 2

Всхожесть семян и биомасса проростков озимого рапса при низкой положительной температуре [Germination and biomass of winter rapeseed at low positive temperature]

Вариант эксперимента	Всхожесть, %	Изменение биомассы относительно контроля, %
Контроль	43.3±13.0	100 ± 13.3
Опыт	56.6±13.3*	115.1±20.3*

Примечание: * ‒ различия достоверны при р < 0.05. Три независимых эксперимента в 3-х биологических повторностях.

Холодовой стресс сопровождается обезвоживанием, повышением осмотического давления, а также окислительным стрессом. Это приводит к повреждению мембран и ДНК, денатурации белков. Осмолиты в значительной степени снижают негативное действие стрессовых факторов на макромолекулы и компоненты клеток. Известно, что в адаптации растений к низким температурам немаловажную роль играют низкомолекулярные органические соединения, такие как сахара и аминокислоты, в частности сахароза и пролин [Moieni-Korbekandi, Karimzadeh, Sharifi, 2014; Jankovska-Bortсevič et al., 2019; Lei et al., 2019]. Поэтому было исследовано влияние бактерии на синтез клетками растений этих соединений. Сравнение внутриклеточных количеств сахарозы и пролина в проростках из семян, обработанных клетками S. socius SMB35^T, и проростках из контрольной группы выявило достоверно значимое снижение количества сахарозы на 35.5% в проростках опытной группы (см. рисунок). В меньшей степени изменилось содержание пролина. Отмечена тенденция к снижению его количества на 13.4% в проростках из семян, обработанных бактерией. Как правило, у инокулированных бактерией растений значительно повышался уровень пролина, но на более поздних стадиях роста [Barka et al., 2006; Mishra et al., 2009].

Влияние инокуляции семян бактерией S. socius SMB35^T на аккумуляцию осмолитов проростками рапса при низкой положительной температуре:

К – проростки из семян, необработанных бактерией, 35 – проростки из семян, обработанных бактерией,

* ‒ различия достоверны при р < 0.01. Три независимых эксперимента в 3-х биологических повторностях

[The effect of seed inoculation with S. socius SMB35^T on the accumulation of osmolytes by rapeseed seedlings at low positive temperatures:

K – seedlings from seeds untreated with the bacterium, 35 – seedlings from seeds treated with the bacterium, * ‒ the differences are significant at p < 0.01. Three independent experiments in 3 biological replications]

Между тем, к снижению количества пролина в клетках растений в условиях холодового стресса может приводить предварительная обработка ауксинами [Jankauskienė et al., 2022]. В некоторых случаях ауксины могут ингибировать процессы, приводящие к накоплению сахарозы [Tao et al., 2022]. По-видимому, это связано с развитием метаболических изменений, способствующих повышению холодоустойчивости за счет других механизмов. Так, было показано, что ауксины содействуют холодовой акклиматизации, увеличивая выработку дегидринов (термостабильных гидрофильных белков), а также модулируя состав и количество полиаминов, снижая содержание малонового диальдегида и перекиси водорода [Jankauskienė et al., 2022; Jankovska-Bortkevič et al., 2023]. Малоновый диальдегид служит основным маркером перекисного окисления липидов и конечным продуктом повреждения жирных кислот, в то время как перекись водорода сама по себе является свободным радикалом, который генерирует другие более опасные свободные радикалы и участвует в оксидативном повреждении клеток.

Поскольку пролин и сахароза играют важную роль в борьбе растений с окислительным стрессом, действуя как эффективные антиоксиданты, удаляя активные формы кислорода и стабилизируя клеточные компоненты, такие как мембраны и белки [Hayat et al., 2012], спад их количества может быть следствием снижения негативного действия окислительного стресса, вызванного низкой температурой.

Растительный гормон гетероауксин является одним из ключевых регуляторов роста и развития растений, занимая ключевое место, обеспечивая интеграцию сигналов абиотического стресса и контроле последующих реакций [Musazade, Mrisho., Fen, 2025]. В условиях холода уровень синтеза ИУК снижается и нарушается его транспорт между клетками. Это обусловлено, в том числе, нарушением работы PIN-белков, которые играют ключевую роль в базипетальном транспорте гетероауксина [Zhu et al., 2015]. Бактерии, продуцирующие ИУК, могут способствовать восстановлению его уровня в клетках растения, тем самым повышая устойчивость к стрессам и стимулируя рост. Это взаимодействие делает ауксинпро-дуцирующие бактерии перспективным инструментом для создания биопрепаратов, помогающих растениям справляться с неблагоприятными абиотическими факторами внешней среды.

Заключение

Проведенное исследование позволило установить существенное влияние инокуляции семян ауксин-синтезирующей бактерией S. socius SMB35^T на рост озимого рапса, который носит дозозависимый характер. Полученные результаты указывают на то, что оптимальная концентрация бактериального штамма SMB35 стимулирует ключевые показатели роста, такие как длина побегов и корней. В то же время превышение оптимальной концентрации приводит к эффекту ингибирования. Применение бактериальных клеток в концентрации, стимулирующей рост, позволило добиться статистически значимого увеличения всхожести семян и биомассы проростков рапса при низкой положительной температуре. Несмотря на это, инокулирование семян бактерией S. socius SMB35^T не привело к увеличению количества осмолитов (сахарозы и пролина) в проростках рапса. Таким образом, определение концентрационной специфичности взаимодействия «бактерия – растение» является важным условием для разработки эффективных и экологически безопасных микробных препаратов для сельского хозяйства. Перспективы работы видятся в продолжении исследований молекулярных аспектов взаимодействия растений с бактериями.