Влияние бактерий Bacillus subtilis на рост и развитие мяты длиннолистной (Mentha longifolia L.) и мелиссы лекарственной (Melissa officinalis L.) при гидропонном выращивании

Введение. В настоящее время традиционное сельское хозяйство сталкивается с рядом проблем, таких как низкое плодородие почв, наличие сорняков и вредителей, использование пестицидов, а также климатические изменения. Альтернативные системы растениеводства, в частности гидропонные, требующие ограниченного количества субстрата и воды, играют важную роль в развитии будущего городского сельского хозяйства [1].

Лекарственные растения обладают разнообразными биологическими свойствами, играющими важную роль в профилактике и лечении различных заболеваний [2]. Так, мелисса лекарственная (мелисса лимонная) с давних времен использовалась для лечения различных заболеваний [3], включая бессонницу, в датской народной медицине [4], в народной медицине Австрии чай с мелиссой и наружное применение ее эфирного масла использовались для лечения заболеваний желудочно-кишечного тракта, нервной системы, печени и желчевыводящих путей [5]. В Хорватии мелисса использовалась для лечения ангины и кашля [6]. Растения рода Mentha (мята) являются одними из важнейших культур в производстве эфирных масел во всем мире и широко используются в качестве ароматизаторов в пищевых продуктах, зубной пасте, фармацевтических препаратах и косметике [7]. Благодаря обильному содержанию фенольных соединений водные экстракты и эфирное масло растений мяты являются потенциальными природными антиоксидантами [8].

Во многих предыдущих исследованиях [9, 10] сообщалось о важной роли Bacillus subtilis в ка- честве биоинокулянта для стимулирования роста и биологического контроля различных сельскохозяйственных культур, таких как пшеницы, риса, кукурузы, капусты, огурца, перца, арбуза, а также лекарственных растений [11, 12].

Разные штаммы B. subtilis различаются по своей способности стимулировать рост растений, контролировать фитопатогены и успешно колонизировать корни [13]. В литературе имеются данные о том, что бактериальная инокуляция B. subtilis L2 значительно увеличила биомассу (на 18 %), площадь (на 30 %) и количество листьев (на 21 %) растений имбиря по сравнению с контролем [14]. B. subtilis B117 оказал существенное влияние на рост и накопление вторичных метаболитов у мелиссы лекарственной [15], при этом воздействие B. subtilis на базилик душистый ( Ocimum basilicum ) привело к увеличению длины побегов и корней, количества листьев, площади листьев и биомассы [16].

Симбиотические взаимодействия между эндофитными бактериями и растениями обеспечивают лучшие условия обитания и защиты для микроорганизмов. В свою очередь, это позволяет бактериям повышать усвоение питательных веществ растениями и продуцировать метаболиты, играющие ключевую роль в реализации рост-стимулирующего эффекта [17]. Так, ранее было выявлено, что штаммы B. subtilis 10-4 и 26D обладают способностью продуцировать такие соединения, как сидерофоры, индол-3-уксусную кислоту (ИУК), и фиксировать атмосферный азот, что усиливает процессы роста растений, к примеру фасоли обыкновенной и пшеницы [18]. Стимулирование роста пророст- ков может быть связано с соединениями гормональной природы, вырабатываемыми микроорганизмами [19, 20], мобилизацией питательных веществ или с изменением редокс-метаболизма проростков [21]. Например, Zhang et al. [22] обнаружили, что синтезируемые бактериями B. subtilis летучие органические соединения (ЛОС) способствуют росту растений за счет увеличения накопления ауксина в корнях.

Несмотря на то, что применение гидропоники является экологически чистым подходом устойчивого растениеводства, данные о влиянии B. subtilis на рост и развитие лекарственных культур в условиях закрытых агроэкосистем практически отсутствуют.

Цель исследования – оценка влияния бактерий Bacillus subtilis (штаммы 10-4 и 26D) на рост и развитие лекарственных растений ( Mentha longifolia L. и Melissa officinalis L.) при выращивании методом гидропоники в условиях закрытых агроэкосистем.

Объекты и методы. В работе использовали два штамма эндофитных PGPB B. subtilis (10-4 и 26D). Штамм 10-4 (рег. номер в ВКПМ B-12988) выделен из пахотных почв Республики Башкортостан в Башкирском НИИСХ УФИЦ РАН (г. Уфа, Россия), идентифицирован и охарактеризован [23]; способен продуцировать ауксины, сидерофоры, фиксировать атмосферный азот, индуцировать рост и стресс-устойчивость растений, а также колонизировать их внутренние ткани (эндофит). Штамм 26D (рег. номер в ВКПМ 016-02-2491-1) – основа коммерческого биопрепарата «Фитоспорин-М» (ООО «НВП «БашИнком», г. Уфа, Россия), выступает в качестве стандарта при исследовании. Клетки B. subtilis (штаммы 10-4 и 26D) культивировали в агаризованной среде Луриа-Бертани (ЛБ) при 37 °C в течение 3–4 сут [23].

Для получения инокулюма, бактериальные клетки пересаживали в жидкую ЛБ среду и культивировали при 37 °С и 180 об/мин в течение 24 ч до достижения концентрации 109 кл/мл, разбавляли стерильной дистиллированной водой до 109 кл/мл (для штамма 10-4) и 109 кл/мл (для штамма 26D) (согласно рекомендациям производителя). Концентрацию клеток определяли по оптической плотности при 600 нм с использованием спектрофотометра UV-2200 c двойным лучом UV/VIS (Jiuxin Group, Shanghai, Китай).

Опыты проводили в климатической камере производства ВИМ (г. Москва, Россия) на селекционном материале мяты длиннолистной Mentha longifolia (L.) Huds. и мелиссы лекарственной Melissa officinalis L., полученных из Всероссийского научно-исследовательского института лекарственных и ароматических растений (г. Москва, Россия).

Клоны изучаемых культур инокулировали B. subtilis 10-4 и 26D методом полива прикорневой зоны растений на 7-е сут мяты длиннолистной и на 10-е сут роста и развития мелиссы лекарственной. Расход суспензии B. subtilis составил 5 мл на одно растение. Контролем служили растения без обработки бактериями.

Оцениваемые параметры включали длину побега, площадь и количество листьев, сырую массу, а также содержание фотосинтетических пигментов. Длину побегов измеряли с помощью линейной шкалы. Площадь и количество листьев определяли с помощью фотопланиметра LI-3100 AREA METER (LI-COR, Северная Каролина, США). Определение сырого вещества проводили на аналитических весах Ohaus EX224/AD (OHAUS, New-Jersey, USA). Для измерений из каждой группы было отобрано по десять растений.

Для определения содержания фотосинтетических пигментов использовали навеску растительного материала массой 100 мг, которую гомогенизировали в 25 мл ацетона. Полученный гомогенат фильтровали, измеряли оптическую плотность фильтрата при длинах волн 662 нм для хлорофилла а (Chl a ), 644 нм для хлорофилла b (Chl b ) и 440,5 нм для каротиноидов (Car) с помощью спектрофотометра UV-2200 c двойным лучом UV/VIS (Jiuxin Group, Shanghai, Китай).

Статистическую обработку результатов проводили по стандартным методикам. Средние значения сравнивались с помощью теста Дункана для проверки значимости полученных данных при уровне вероятности p ≤ 0,05.

Результаты и их обсуждение. При оценке эффекта инокуляции B. subtilis на надземную часть растений мяты длиннолистной и мелиссы лекарственной наблюдались изменения в длине побегов, площади листовой поверхности и количестве листьев в зависимости от применяемого штамма 10-4 и 26D (рис.).

А

В

С

D

Влияние Bacillus subtilis (штаммы 10-4 и 26D) на длину побегов (А), площадь листа (В), количество листьев (С) и биомассу (D) растений мяты длиннолистной и мелиссы лекарственной. Данные представляют собой средние значения трех повторений (n = 30); разные буквы вверху столбцов обозначают статистически значимые различия между группами (р < 0,05); тест Дункана рассчитывался по каждой культуре отдельно

The effect of Bacillus subtilis (strains 10-4 and 26D) on the length of shoots (A), leaf area (B), number of leaves (C) and biomass (D) of longleaf mint and lemon balm plants. The data represent the average values of three repetitions (n = 30); different letters at the top of the columns indicate statistically significant differences between the groups (p < 0.05); the Duncan test was calculated for each culture separately

Результаты сравнения средней длины побегов растений между различными штаммами (10-4 и 26D) B. subtilis показали, что применение каждого из биологических агентов по-разному влияло на длину побегов (см. рис., а ). Штамм 26D не оказывал существенного влияния на ростовые показатели обеих культур: длина побегов мяты длиннолистной в варианте с применением штамма 26D составила 47,2 см (в контроле 43,1 см), у мелиссы лекарственной – 52,0 см (в контроле 51,0 см) (рис., а ).

В варианте опыта сj штаммом 10-4 было обнаружено незначительное, но достоверное торможение роста: для мяты длиннолистной и мелиссы лекарственной длина побегов была ниже по сравнению с контролем на 15,8 (37,2 см при контроле 43,1 см) и 19,4 % (42,7 см при контроле 51,0 см) соответственно (рис., а ).

Оба штамма (B. subtilis 10-4 и 26D) продемонстрировали существенное положительное воздействие на площадь листовой поверхности исследуемых культур (см. рис., b). Обработка штаммом 26D привела к увеличению средней площади листовой поверхности на 41,4 % у мяты длиннолистной (до 337,97 см²/растение) и на 43,2 % у мелиссы лекарственной (до 1680,96 см2/растение) по сравнению с контрольными растениями.

Ранее было отмечено, что PGPВ повышают продуктивность растений мяты длиннолистной [24], а в исследовании, представленном в [25], авторы показали аналогичные результаты при инокуляции B. subtilis для Mentha spicata , что согласуется с нашими результатами (см. рис., D ).

Штамм 10-4 оказал более выраженное стимулирующее действие, увеличив среднюю площадь листьев на 72,1 % у мяты длиннолистной (до 411,3 см2/растение) и на 58,0 % у мелиссы лекарственной (до 1854,3 см²/растение) по сравнению с контролем.

Кроме того, выявлено, что обработка штаммом 10-4 способствовала значительному увеличению (на 65,4 % по сравнению с контролем) количества листьев у мяты длиннолистной (до 143,20 шт/растение). В то же время применение штамма 26D не оказывало влияния на количество листьев относительно контрольных растений (см. рис., С ).

Что касается мелиссы лекарственной, обработка штаммами 10-4 и 26D способствовала увеличению количества листьев по сравнению с контрольными вариантами. Применение B. sub-tilis 26D приводило к появлению наибольшего количества листьев (до 522,70 шт/растение, что на 55,1 % превышает контроль); тогда как при обработке B. subtilis 10-4 количество листьев увеличивалось до 480,60 шт/растение, что на 42,7 % больше, чем у контрольных растений. Применение B. subtilis приводило к достоверному увеличению биомассы растений как у мяты длиннолистной (штамм 10-4), так и у мелиссы лекарственной (10-4 и 26D) (рис., D). Штамм 26D не повлиял на изменение биомассы у растений мяты длиннолистной, значения находились на уровне контроля. Однако у мелиссы лекарственной данный штамм способствовал увеличению биомассы на 21,6 % по сравнению с контролем. Наиболее эффективным вариантом обработки оказался штамм 10-4, который стимулировал рост биомассы на 84,0 % у мяты длиннолистной и на 52,8 % у мелиссы лекарственной относительно контрольных растений (рис., D).

Продуктивность культурных растений является результатом эффективности процессов фотосинтеза в течение вегетационного периода и зависит от содержания фотосинтетических пигментов в листьях.

Фотосинтетические пигменты являются биологически активными соединениями, имеющими большое значение для пищевой, косметической и фармацевтической промышленности. Хлорофиллы необходимы для развития растений, поскольку они отвечают за улавливание солнечной энергии, необходимой для фотосинтеза. Наиболее распространенной формой фотосинтетических пигментов у высших растений является Chl a . Согласно предположению Zhang et al. [26], воздействие летучих органических соединений, продуцируемых B. subtilis , повышало эффективность фотосинтеза и рост растений арабидопсиса, вызывая накопление хлорофилла.

Наши результаты показали, что применение B. subtilis 10-4 и 26D оказывает дифференцированное влияние на накопление фотосинтетических пигментов Chl a , Сhl b , Chl( а+b ) и Car (табл.).

Влияние Bacillus subtilis (штаммы 10-4 и 26D) на накопление фотосинтетических пигментов в листьях мяты длиннолистной и мелиссы лекарственной

The effect of Bacillus subtilis (strains 10-4 and 26D) on the accumulation of photosynthetic pigments in the leaves of longleaf mint and lemon balm

Культура	Вариант опыта	Содержание, мг/г сы		рой массы растений
		Chl a	Chl b	Chl( а+b )	Car
Мята длиннолистная	Контроль	7,82±0,48b*	2,74±0,16b	10,56±0,54b	2,19±0,13b
	Штамм 26D	10,60±0,64a	3,66±0,22a	14,26±0,67a	2,88±0,18a
	Штамм 10-4	8,45±0,51b	3,10±0,18b	11,55±0,60b	2,33±0,14b
Мелисса лекарственная	Контроль	8,41±0,51b	3,88±0,17b	12,29±0,55b	2,49±0,13b
	Штамм 26D	9,10±0,55ab	4,54±0,21a	13,64±0,63a	2,59±0,16ab
	Штамм 10-4	9,93±0,60a	4,45±0,19a	14,38±0,67a	2,78±0,15a

Примечание. (*) – тест Дункана рассчитывался по каждой культуре отдельно. Разные буквы обоз- начают статистически значимые различия между группами (р < 0,05).

В листьях мяты длиннолистной обработка B. subtilis 26D приводила к увеличению содержания Chl а , Chl b и их общего содержания Chl( а+b ), а также Car на 35 %, 34, 35 и 32 % соответственно по сравнению с контролем. В то же время у мелиссы лекарственной штамм 26D не оказывал влияния на содержание Chl а и Car, но вызывал повышение Chl b и Chl( а+b ) на 17 и 11 % соответственно по сравнению с контролем.

Обработка B. subtilis 10-4 не приводила к существенным изменениям в накоплении фотосинтетических пигментов в листьях мяты длиннолистной, все значения находились на уровне контрольных значений. Однако у мелиссы лекарственной данный штамм стимулировал повышение содержания Chl а , Chl b , Chl ( а+b ) и Car на 18,1 %; 14,7; 17,0 и 11,6 % соответственно по сравнению с контролем.

Обработка растений мяты длиннолистной и мелиссы лекарственной штаммами B. subtilis оказала дифференцированное влияние на содержание фотосинтетических пигментов. Штамм 26D значительно повышал уровни хлорофиллов a, b и каротиноидов в листьях мяты, тогда как у мелиссы этот эффект наблюдался лишь для хлорофилла b и общего содержания хлорофилл (a+b). В отличие от этого штамм 10-4 не изменял содержание фотосинтетических пигментов в мяте, но стимулировал их на- копление в мелиссе. Эти результаты подчеркивают важность выбора подходящего штамма бактерий для оптимизации роста и развития конкретных видов растений.

Заключение. Результаты проведенного исследования показали, что инокуляция B. subtilis (штаммы 10-4 и 26D) стимулировала ростовые параметры растений (длину побегов, площадь и количество листьев, общую биомассу). Обработка B. subtilis также привела к заметным положительным изменениям в содержании фотосинтетических пигментов в листьях, причем наибольшие эффекты наблюдались при использовании штамма 26D для мяты длиннолистной и штамма 10-4 для мелиссы лекарственной. Наиболее эффективной оказалась обработка штаммом 10-4, которая увеличила прирост биомассы на 84,0 % у мяты длиннолистной и на 52,8 % у мелиссы лекарственной по сравнению с контрольными растениями.