Влияние базисной терапии на показатели апоптотической и цитокиновой активности у детей с хронической гастродуоденальной патологией

Основным методом, позволяющим выявить Н. pylori и оценить его вирулентный потенциал (серотип), является метод Western- blot. Данный метод позволяет визуализировать полный серологический профиль Helicobacter pylori, обнаружить и дифференцировать более вирулентный тип I Н. pylori от типа II, а добавление собственного рекомбинантного протеина Н. pylori (антигена) – отличить текущую инфекцию (Current infection marker-маркер текущей инфекции) от ранее перенесенной [3].

Цель исследования. Изучение динамики показателей апоптотической и цитокиновой активности у детей с гастродуоденальной патологией на стационарном этапе лечения и оценка вирулентного потенциала Н. pylori.

Материалы и методы. Под наблюдением находилось 103 ребенка с хронической гастродуоденальной патологией (ХГДП) в периоде обострения, проходивших лечение на гастроэнтеорологических койках КРУ «Детская клиническая больница» г. Симферополя в 2009–2011 гг. в возрасте 6–17 лет. Группу контроля составили 20 практически здоровых детей, сопоставимых по полу и возрасту.

Нами были выделены три основные группы по принципу выявляемой нозологии и наличию Н. pylori. Так, в 1 группу вошло 47 (45,6 %) детей с ХГДП, ассоциированной с Н. pylori, во 2 группу вошел 41 (39,8 %) ребенок с ХГДП, не ассоциированной с Н. pylori, в 3 группу – 15 (14,6 %) детей с язвенной болезнью двенадцатиперстной кишки (ЯБ ДПК), ассоциированной с Н. pylori.

Иммунологическим методом с помощью ИФА определяли динамику показателей апоптотической активности посредством изучения количественного содержания CD-95 и Аннесина V во всех трех группах, а также цитокиновой активности посредством изучения количественного содержания TNF-α, ИЛ-8, ИЛ-10 и соотношения ИЛ-8/ИЛ-10.

Дополнительно был применен метод Western-blot для определения вирулентного потенциала Н. pylori. Метод Western-blot – это встречная преципитация в геле антител в сыворотке крови больного с различными белками Н. pylori, меченными зондами, подвергнутыми разделению по молекулярной массе с помощью электрофореза и нанесенными на нитроцеллюлозу. Для этого в сыворотке крови методом Western-blot определяли наличие специфических IgG к антигенам Н. pylori: CagA p120 (белок, ассоциированный с цитотоксином А, высокоспецифичен), VacA p95 (вакуолизирующий цитотоксин А, высокоспецифичен). В качестве тест-системы применяли набор реагентов EUROIMMUN Anti-Н. pylori – WESTERNBLOT (IgG). В зависимости от результатов серологического исследования штаммы Н. pylori подразделялись на 4 вышеуказанных серотипа. Результаты обрабатывались с помощью специальной программы AutoScan 2.0, позволяющей получать графическое изображение антигенного профиля инфицирующего микроорганизма с определением соответствующего серотипа.

При проведении ИФА использовался комплект оборудования фирмы AWARENESS Technology Inc. (USA): промыватель-планшет автоматический Stat Fax 2600, микроплан-шетный инкубатор-шейкер Stat Fax 2200 и иммуноферментный плашечный автоматический анализатор Stat Fax 2100.

Маркер sCD95 определялся наборами ИФА sCD 95(APO1/ Fas) ELISA KIT фирмы DIACLONE Research (Франция), предназначенными для количественного измерения in vitro растворимого CD95 (APO-1, Fas) в плазме, сыворотке, буферизованных растворах или среде культуры клеток. Фотометри-рование лунок проводили на Stat Fax 2100 при длине волны 450 нм. Для перевода полученных результатов в единицы ОП измерений (ЕД/мл) строили калибровочный график.

Для количественного определения Анне-сина V использован иммуноферментный набор Annexin V Elisa (кат. NBMS 252, производитель Bender Medsystems). После остановки ферментативной реакции проводили фотометрирование лунок на Stat Fax 2100 при длине волны 450 нм. Далее, с учетом значений оптической плотности контрольных проб, проводили математическую обработку результатов анализов.

Содержание TNF-α определяли с помощью ТОО-протеинового контура (Санкт-Петербург).

ИЛ-8 определялся набором «ИНТЕР-ЛЕЙКИН-8-ИФА-БЕСТ» А-8762 фирмы «Вектор Бест» (Россия), предназначенным для количественного определения человеческого ИЛ-8 в биологических жидкостях человека и культуральных средах. Фотометрирование лунок проводили на Stat Fax 2100 при длине волны 450 нм. Для перевода полученных результатов в единицы ОП измерений (ЕД/мл) строили калибровочный график и с учетом значений оптической плотности контрольных проб проводили математическую обработку результатов анализов.

ИЛ-10 определялся набором «ИНТЕР-ЛЕЙКИН-10-ИФА-БЕСТ» А-8774 фирмы «Вектор Бест» (Россия), предназначенным для количественного определения человеческого ИЛ-10 в биологических жидкостях человека и культуральных средах. Фотометри-рование лунок проводили на Stat Fax 2100 при длине волны 450 нм. Для перевода полученных результатов в единицы ОП измерений (ЕД/мл) строили калибровочный график и с учетом значений оптической плотности контрольных проб проводили математическую обработку результатов анализов.

Диагноз хронической гастродуоденальной патологии выставлялся согласно классификации МКБ-10.

Лечение проводилось с учетом протоколов терапии по основному заболеванию.

Статистическую обработку полученных данных проводили с применением интегрированного пакета прикладных программ Statistica 6.0 for Windows XP в соответствии с общепринятыми методами медицинской статистики.

Результаты и обсуждение. При проведении обследования в клинической картине у всех детей достоверно преобладал болевой синдром с локализацией в эпигастральной области во всех трех группах в сравнении с группой здоровых детей (р<0,001). Достоверных различий в характеристике болевого синдрома при другой локализации мы не обнаружили.

Диспептический синдром достоверно проявлялся во всех трех группах клиническими симптомами в виде тошноты, рвоты, изжоги, снижения аппетита, запоров с преобладанием симптома тошноты во всех трех группах (р<0,001).

Синдром неспецифической интоксикации проявлялся в виде утомляемости, слабости, головной боли и встречался достоверно чаще, чем у детей контрольной группы, являясь проявлением хронической неспецифической интоксикации (р<0,001).

Общеклинический профиль обследования у детей с ХГДП не выявил каких-либо нарушений, и все показатели не выходили за рамки общепринятых норм.

Таким образом, приведенные данные показывают, что дети всех групп были однородны по основным признакам заболевания.

В ходе исследования нами проводилась оценка динамики (при поступлении и при выписке) показателей апоптотической (Fas (CD95) и Аннексин V) и цитокиновой активности (TNF-α, ИЛ-8, ИЛ-10, ИЛ-8/ИЛ-10). Их характеристика представлена в табл. 1.

Проведя анализ полученных данных, можно сделать вывод о том, что как при поступлении, так и после проведенного лечения отмечались достоверно более высокие уровни показателей апоптотической (Fas (CD95) и Аннексин V) и цитокиновой (FTN- α , ИЛ-8) активности у детей из 1 группы с IgG к штамму Н. pylori I типа (CagA+) в сравнении с группой контроля (р<0,001).

Таблица 1

Характеристика показателей апоптотической и цитокиновой активности у детей с ХГДП на стационарном этапе в зависимости от вирулентности Н. pylori (M±m)

Показатель	Контрольная группа (n=20)	1 группа тип I (CagA+) (n=18)		2 группа тип II (CagA-) (n=29)
		до	после	до	после
Fas (CD95), пг/мл	400,67±4,05	608,68±11,46 р<0,001 р 1 <0,05	475,00±8,98 р<0,001 р 1 <0,01 р 2 <0,001	555,00±12,12 р<0,001	427,11±5,32 р<0,05 р 2 <0,001
Аннексин V, U/мл	6,25±0,44	15,28±0,99 р<0,001 р 1 <0,05	8,25±0,42 р<0,05 р 1 >0,05 р 2 <0,001	12,57±0,61 р<0,001	8,39±0,45 р<0,05 р 2 <0,01
FTN- α , пг/мл	29,86±3,97	157,57±5,65 р<0,001 р 1 <0,001	122,85±6,50 р<0,001 р 1 <0,01 р 2 <0,01	101,31±6,40 р<0,001	87,01±1,93 р<0,001 р 2 <0,05
ИЛ-8, пг/мл	8,19±0,54	30,38±0,55 р<0,001 р 1 <0,001	12,90±1,19 р<0,05 р 1 <0,05 р 2 <0,001	15,20±1,49 р<0,01	9,44±0,27 р<0,05 р 2 <0,05
ИЛ-10, пг/мл	4,10±0,25	3,45±0,12 р<0,05 р 1 >0,05	5,69±0,11 р<0,01 р 1 >0,05 р 2 <0,001	3,46±0,14 р<0,05	5,64±0,10 р<0,01 р 2 <0,001
ИЛ8/ИЛ10	2,11±0,19	8,98±0,32 р<0,001 р 1 <0,001	2,43±0,32 р>0,05 р 1 <0,05 р 2 <0,001	4,35±0,43 р<0,01	1,69±0,06 р<0,05 р 2 <0,001

Примечание. р – достоверность различия с аналогичными показателями контроля; р₁ – достоверность различия с аналогичными показателями 2-й группы; р₂ – достоверность различия с аналогичными показателями до лечения.

Выводы:

• 1.    У детей с ХГДП имеет место усиление процессов апоптотической и цитокино-вой активности, более выраженное в группе с деструктивными изменениями в слизистой оболочке гастродуоденальной зоны и в группах, ассоциированных с Н. рylori.

• 2.    В результате лечебных мероприятий наблюдается уменьшение уровня показателей sCD95, Аннексина V и провоспалительного ИЛ-8 и увеличение противовоспалительных цитокинов у детей всех групп, что подтверждает снижение апоптотической и цитокино-вой активности, косвенно свидетельствующее об усилении репаративных процессов,

• 3.    У детей с ХГДП имеет место усиление процессов апоптотической и цитокино-вой активности в сравнении с группой контроля, более выраженное у пациентов с IgG к штамму Н. pylori I типа CagA-позитивный.

стихании воспалительного процесса, а также исчезновение жалоб и улучшение клинической картины.

INFLUENCE OF BASE THERAPY ON INDICATORSOF APOPTOTIC AND CYTOKINE ACTIVITYIN CHILDREN WITH CHRONIC GASTRODUODENAL PATHOLOGY

N.V. Lagunova, A.O. Kot

Crimea State Medical University named after S.I. Georgievsky, Simferopol, Ukraine