Влияние блокады опиатных рецепторов на функциональную активность перитонеальных макрофагов в условиях острого и хронического переохлаждения

нием, к подавлению [Salman et al., 2000] или активации [Kizkai et al., 2001] иммунной системы.

Цель работы – исследовать влияние блокады опиатных рецепторов на уровень кортикостерона в плазме крови, продукцию активных форм кислорода, IL-1 P , TNF- a , IL-10 перитонеальными макрофагами при остром и хроническом холодовом стрессе у мышей in vivo .

Материалы и методы

Эксперимент выполнен на белых мышах-самцах массой тела 20–22 г. Животные содержались в условиях лабораторного вивария, при естественном освещении, неограниченном доступе к воде и кормам. Эксперименты проведены в соответствии с этическими нормами и рекомендациями по гуманизации работы с лабораторными животными, отраженными в «Европейской конвенции по защите позвоночных животных, используемых для экспериментальных и других научных целей» (Страсбург, 1986).

Мыши подвергались острому переохлаждению при -20 ° С в течение 10 или 60 мин., а также длительному переохлаждению при -4 ° С в течение 4 ч. на протяжении 7 сут. Антагонист опиатных рецепторов налоксона гидрохлорид вводили в дозе 0.2 мг/кг подкожно за 20 мин до стресса при остром переохлаждении и подкожно ежесуточно за 20 мин. до охлаждения и повторно через 3 ч. от первого введения при длительном. Все животные были разбиты на следующие группы: 1-я – контрольная, 2-я – стресс, 3-я - стресс на фоне налоксона, 4я – введение одного налоксона. Через 1 ч. после окончания стрессорного воздействия мышей выводили из эксперимента методом декапитации под эфирным наркозом. Плазму крови собирали и замораживали, из брюшной полости выделяли перитонеальные макрофаги по стандартной методике [Фримель, 1987].

Оценку продукции активных форм кислорода (АФК) перитонеальными макрофагами осуществляли с использованием реакции люминолзависи-мой хемилюминесценции (ЛЗХЛ). Реакцию проводили в 96-луночных плоскодонных планшетах, каждая лунка содержала 105 клеток в 100 мкл раствора Хенкса. В качестве индуктора ЛЗХЛ использовали опсонизированный зимозан в концентрации 150 мкг/мл. В качестве маркера выраженности реакции ЛХЗЛ использовался люминол 10-5М (Sigma). Регистрация результатов проводилась в течение 1 ч. с интервалом в 5 мин. с помощью многофункционального спектрофотометра TECAN (Австрия).

Статистическая обработка результатов проведена с использованием двухфакторного дисперсионного анализа и LSD-критерия для межгруппового сравнения. Все данные на рисунках представлены в виде средней и её стандартной ошибки (M ± m).

Результаты и их обсуждение

Установлено, что острое, 10-минутное, а также длительное переохлаждение в течение 7 сут. не влияло на спонтанную продукцию АФК перитонеальными макрофагами. Острое переохлаждение мышей в течение 60 мин. усиливало спонтанную продукцию АФК по отношению к животным контрольной группы с 10- по 60-ю мин. наблюдения. Предварительное введение животным налоксона приводило к ослаблению эффекта стресса, однако с 35- по 60-ю мин. регистрации реакции показатели люминесценции в этой группе животных оставались статистически значимо выше значений по отношению к контрольной группе (данные не приводятся).

В стимулированных зимозаном культурах (рис. 1) 10-минутный холодовой стресс угнетал продукцию АФК макрофагами в первые 35 мин. наблюдений, эффект нивелировался на фоне введения налоксона. В группе животных, подвергнутых 60минутному стрессу, напротив, наблюдалась стимуляция продукции АФК с 5 до 45 мин. наблюдения, которая отменялась на фоне введения животным налоксона. Хронический холодовой стресс в стимулированных зимозаном культурах усиливал продукцию АФК с 15- по 60-ю мин. исследования, в 3-й группе животных, на фоне блокады опиатных рецепторов отмечается усиление кислородзависи-мой микробицидности с 10- по 25-ю мин. исследования (рис. 2, Б). Таким образом, блокада опиатных рецепторов приводила к частичной отмене эффектов холодового стресса на продукцию АФК макрофагами.

Как острое, так и хроническое переохлаждение не оказывало значимого влияния на продукцию IL-1Р (данные не приводятся). Продукция макрофагами IL-10 в условиях острого холодового стресса усиливалась независимо от продолжительности холодового воздействия, в условиях стимуляции и без неё, и отменялась на фоне блокады опиатных рецепторов (рис. 2). Хронический холодовой стресс в спонтанных пробах усиливал продукцию IL-10, которая нивелировалась введением животным налоксона. В зимозан-индуцированных культурах статистически значимое стимулирующее действие длительного пререохлаждения на синтез IL-10 зарегистрировано только в группе животных, подвергнутых стрессу на фоне налоксона. У животных, получавших один стресс, наблюдалась лишь тенденция к усилению продукции IL-10 стимулированными макрофагами.

время, мин

Б

время, мин

В

Рис. 1 . Влияние 10 мин. (А), 60 мин. (Б) и хронического (В) холодового стресса на зимозан-стимулированную продукцию АФК перитонеальными макрофагами мыши в условиях блокады опиатных рецепторов.

*-p<0.05 к контролю, (n=9)

В дальнейшем мы оценивали роль блокады опиатных рецепторов в регуляции продукции кортикостерона при холодовом стрессе (данные не приводятся). Как в условиях острого, так и хронического переохлаждения, концентрация кортико- стерона в плазме крови экспериментальных животных значительно возрастала, однако предварительное введение мышам налоксона на уровень кортикостерона в периферической крови влияния не оказывало.

А

Б

В

Рис. 2 . Влияние 10 мин. (А), 60 мин. (Б) и хронического (В) холодового стресса на продукцию IL-10 перитонеальными макрофагами в условиях блокады опиатных рецепторов.

По оси абсцисс: 1 – контроль, 2 – стресс, 3 – стресс + налоксон, 4 – налоксон. По оси ординат концентрация IL-10 (пг/мл). *-p<0,05 к контролю, (n=8)

Таким образом, направленность действия острого холодового стресса на функции макрофагов зависела как от исследуемого параметра, так и от времени воздействия, при этом блокада опиатных рецепторов существенно модифицировала имму-норегуляторные эффекты острого переохлаждения. Так, более короткое, 10-минутное, охлаждение приводило к угнетению образования активных форм кислорода, в то время как модель 60 мин. и хронического охлаждения приводили к усилению выраженности респираторного взрыва в макрофагах. Динамика секреции макрофагами IL-1β на фоне используемых нами вариантов холодового стресса статистически значимо не изменялась. По-видимому, эффект, оказываемый холодовым стрессом на продукцию IL-1β, сильно зависит от времени экспозиции и температуры воздействия [Zhu et al., 1996; Tringali et al.; 2000; Kizkai et al., 2001; Zhang et al., 2015]. Очевидно, что модели холодового стресса с более низкими температурами и коротким периодом экспозиции, как и использованные нами в настоящей работе, к статистически значимым изменениям продукции IL-1β не приводят. В то же время продукция IL-10 усиливалась независимо от длительности холодового стресса. В обоих случаях, при оценке влияния стресса как на продукцию АФК, так и на продукцию цитокинов, эффект холодового воздействия полностью или частично отменялся введением налоксона, что говорит о прямом участии эндогенных опиоидов в регуляции функций макрофагов при переохлаждении, независимо от направленности иммунорегуляторного действия стресса. Прямое действие эндогенных опиоидов на функциональную активность клеток иммунной системы при холодовом стрессе подтверждается фактом отсутствия влияния блокады опиатных рецепторов на уровень кортикостерона.

Работа поддержана грантом AAAA-A18-118030790046-9.