Влияние циклоспорина а на фибробласты теноновои капсулы человека: исследование in vitro

Rossinskaya VV, Boltovskaya VV, Germanova VN, Karlova EV, Kulagina LN. The effect of cyclosporine a on human tenon fibroblasts: in vitro study. Morfologicheskie Vedomosti – Morphological Newsletter. 2021;29(2):592. (4).592

Article received 21 October 2020

Article accepted 6 July 2021

Введение. Рубцевание конъюнктивы и теноновой капсулы является нежелательным эффектом при выполнении мно- гих вмешательств на переднем отрезке глаза. Данная проблема особенно актуальна в хирургии глаукомы, в которой послеопе- рационное рубцевание является главной причиной снижения эффективности гипотензивных операций с течением времени. Для улучшения исходов хирургии глаукомы было предложено применение различных противовоспалительных препаратов, антиметаболитов и цитостатиков [1-4]. Однако существующие на сегодняшний день методы коррекции заживления послеоперационной раны либо недостаточно эффективны, либо значительно увеличивают вероятность развития серьезных осложнений. На настоящем этапе развития науки избирательное воздействие на отдельные звенья сложного процесса воспаления считается наиболее перспективным в отношении снижения интенсивности избыточного разрастания соединительной ткани после операции [2, 3, 5]. К одним из таких веществ относится иммунодепрессант циклоспорин А (далее - ЦсА).

ЦсА является ингибитором каль-цинейрина и оказывает иммунодепрессивное действие за счет ингибирования синтеза интерлейкина 2 (ИЛ-2) CD4+ Т-хелперами [6]. Рецепторы к ИЛ-2 обнаружены на многих иммунокомпетентных клетках, в том числе Т- и В-лимфоцитах и макрофагах, а также, по некоторым данным, на кератиноцитах и фибробластах [7]. На ранних этапах заживления раны комплексное действие ИЛ-2 как прямо, так и опосредованно приводит к увеличению интенсивности синтеза некоторых провос-палительных цитокинов и факторов роста, в том числе стимулирующих активацию и пролиферацию фибробластов (FGF, TGF-β, IGF-1, TNF, ИЛ-1) [7-8]. Только через 10-14 дней после возникновения повреждения в ране, предположительно, появляются молекулы-ингибиторы ИЛ-2, которые способствуют снижению интенсивности воспаления и ограничивают избыточный синтез компонентов соединительной ткани [7]. Поэтому местное ингибирование синтеза ИЛ-2 в первые 10-14 дней после возникновения раны может дополнительно снизить интенсивность рубцевания.

Помимо основного иммунодепрессивного действия некоторыми авторами был обнаружен прямой антипролифера-тивный эффект ЦсА в отношении фибробластов. В частности, в концентрациях 1-

10 мкг/мл ЦсА подавлял пролиферацию фибробластов конъюнктивы, полученных от пациентов с весенним катаром и рубцу-ющим пемфигоидом конъюнктивы. При концентрациях ЦсА более 10 мкг/мл наблюдали гибель большинства клеток в культуре [9]. При исследовании влияния ЦсА на фибробласты, полученные из тканей птеригиума, было выявлено нарушение жизнеспособности данных фибробластов через 6 дней после однократного воздействия ЦсА в концентрации 0,05% на культуру клеток [10].

Также было проведено несколько исследований по определению концентраций ЦсА, не оказывающих отрицательного воздействия на ткани глаза. Выявлено, что цитотоксичность препарата в отношении большинства клеток глаза, в том числе клеток Chang сonjunсtiva (клон 1 ‑ 5 С ‑ 4 конъюнктивы), клеток заднего эпителия роговицы и пигментного эпителия сетчатки, проявляется при длительном воздействии ЦсА в концентрациях более 5 мкг/мл. Клетки стромы роговицы сохраняли свою жизнеспособность при концентрациях ЦсА до 250 мкг/мл [11,12].

При хирургии глаукомы основным источником фибробластов, мигрирующих к месту операционной травмы и обеспечивающих синтез компонентов соединительной ткани, является тенонова капсула [13]. В современной литературе не описано влияние ЦсА на фибробласты теноновой капсулы человека, что и обусловило необходимость проведения исследования на данном виде культуры клеток.

Цель исследования: оценка анти-пролиферативного эффекта и цитотоксичности циклоспорина А на фибробласты теноновой капсулы человека при длительном воздействии.

Материалы и методы исследования. Исследование проводили в лаборатории культур клеток биотехнологического отдела Института экспериментальной медицины и биотехнологии человека Самарского госумедуниверситета. Для получения первичных культур клеток образцы теноновой капсулы человека были получены у 7 пациентов Самарской областной клинической офтальмологической больницы имени Т.И. Ерошевского путем биопсии во время выполнения офтальмохирургических вмешательств после одобрения процедур исследования локальным комитетом по биоэтике Самарского госумедуниверси-тета и получения добровольного информированного согласия пациентов. Транспортировку материала осуществляли в стерильных условиях с последующим контролем стерильности. Клетки выращивали по методике первичных эксплантатов, описанной К.Н. Гринбергом [14], в собственной модификации. При этом использовали полную ростовую среду, включавшую в себя питательную среду 199, 10%-ю эмбриональную телячью сыворотку («Биолот», Россия) и гентамицин в концентрации 40 мкг/мл. Культивирование осуществляли в СО2-инкубаторе (МСО-18АC, Sanyo, Япония) при постоянной влажности и температуре 37°С, при содержании СО2 5%.

Для определения антипролифера-тивной активности и цитотоксичности циклоспорина А фибробласты высеивали в дозе 2×10⁴ клеток/см² на дно лунок культуральных планшетов и культивировали в полной ростовой среде. По достижении конфлуентности монослоя 80% питательную среду заменяли новой, в которую вводили циклоспорин А в составе концентрата для приготовления раствора для внутривенных инфузий (Сандиммун, Novartis Pharma, Швейцария) до получения концентраций ЦсА в среде от 0,05 мкг/мл до 2,0 мкг/мл. Далее культивирование продолжали в СО 2 инкубаторе в течение 7 дней. В питательную среду культур группы контроля не вносили дополнительных лекарственных препаратов. В каждой серии эксперимента исследовали по 5 повторов культур клеток.

Ежедневно с помощью аппаратнопрограммного комплекса на базе инвертированного микроскопа Olympus CKX 41 производили морфологическую оценку и фоторегистрацию культур. На 7-е сутки для выявления клеток с поврежденными мембранами или с нарушенным метаболизмом производили окраску монослоя трипановым синим, суданом IV и гематоксилином, а также набором флуоресцентных красителей («Live/Dead Cell-Mediated Cytotoxicity Kit», Invitrogen, США).

Для оценки антипролиферативной активности и возможной цитотоксичности ЦсА определяли плотность монослоя, индекс пролиферации (IP) по формуле IP=N t /N 1 , время удвоения культуры (TD) по формуле TD=t×lg2/lg(N t /N 1 ), количество удвоений культуры (KD) по формуле KD=(lg(N t )-lg(N 1 ))/lg2, в которой N 1 – плотность клеток в монослое через 24 часа после посадки клеток, N t – количество клеток монослоя на момент определения показателя, t – время роста культуры в часах. Время удвоения культуры и индекс пролиферации определяли с 1 по 3 дни эксперимента, когда культура клеток находилась в фазе логарифмического роста. Количество удвоений культуры определяли за весь период исследования – 7 дней. Также на 7 сутки определяли ядерно-цитоплазматическое соотношение (NCI) по формуле: NCI=S N /S c , в которой S N – площадь ядра, S c – площадь цитоплазмы. При определении вышеперечисленных показателей использовали программное обеспечение CellSens Standart 1.7 («Olympus», Япония). Статистическую обработку производили с помощью программного обеспечения STATISTICA 12.0. Поскольку распределение признаков, исследованное с помощью критериев Колмогорова-Смирнова и Шапиро-Уилка, не было нормальным, для сравнения групп использовали непараметрические методы анализа. Различия считали статистически значимыми при р<0,05.

Результаты исследования и обсуждение. В течение всего эксперимента клетки во всех исследуемых концентрациях ЦсА сохраняли хорошую адгезивную способность. Границы клеток были четкими, цитоплазма гомогенной. Хорошо визуализировались ядра. Исходное значение плотности монослоя до внесения в культуру ЦсА было определено через 24 часа после пересева по окончании лаг-фазы роста культуры и составило 177,3±5,3 кл/мм2 без значимых различий между исследуемыми культурами. Однако уже в течение первых суток наблюдали различную реакцию культур на внесение ЦсА в питательную среду: в группах контроля, группах концентраций 0,5 и 1,0 мкг/мл отмечали незначительное снижение плотности моно- слоя, в то время как в группах концентраций 0,05, 0,2 и 2,0 мкг/мл наблюдали некоторое увеличение плотности (табл. 1). Различная реакция культур на внесение в питательную среду препарата вне зависимо- сти от его концентрации может быть обусловлена процессами адаптации клеток к изменившимся условиям культивирования.

Таблица 1

Динамика изменения плотности монослоя фибробластов при культивировании в различных концентрациях циклоспорина А

	Плотность монослоя (кл/мм2)
Концентрация ЦсА, мкг/мл	0,0	0,05	0,2
Исходная плотность	177,3±5,3
1 сутки	151,0±2,9	235,4±5,9*	224,2±4,4*
3 сутки	341,0±18,9	399,2±7,6	336,8±10,9
7 сутки	446,2±0,7	447,4±19,0	378,8±3,8*
Концентрация ЦсА, мкг/мл	0,5	1,0	2,0
Исходная плотность	177,3±5,3
1 сутки	150,4±4,0	135,4±2,2*	237,6±6,7*
3 сутки	220,2±2,9*	189,8±0,9*	287,7±3,8*
7 сутки	233,2±5,5*	75,0±1,6*	377,8±15,6*

Примечание: *- р<0,05 в сравнении с контрольной группой (0,00 мкг/мл)

С 1 по 3 сутки после добавления ЦсА в питательную среду исследуемые культуры находились в фазе логарифмического роста, в которую наблюдается наиболее интенсивная клеточная пролиферация. Поэтому, главным образом, именно в эту фазу определяли антипро-лиферативную активность ЦсА. Изменение плотности монослоя в фазу логарифмического роста находилось в обратной зависимости от концентрации ЦсА с коэффициентом корреляции Спирмена равным 0,9. Наибольшее увеличение плотности наблюдали в группе контроля, в которой ее прирост за данный промежуток времени составил 190±21,6 кл/мм². Достоверно меньшие значения были получены в группе ЦсА: 163,8±8,5; 112,6±9,1; 69,8±6,0; 54,4±2,9 кл/мм² для концентраций 0,05; 0,2; 0,5 и 1,0, соответственно. Наименьшее изменение плотности было в группе с концентрацией ЦсА 2,0 мкг/мл - 51,8±7,7 кл/мм².

С 4 по 7 сутки культуры переходили в стационарную фазу, в течение которой пролиферация клеток замедлялась во всех группах. К 7 суткам плотность монослоя была наибольшей в группе контроля -446,2±0,7 кл/мм2 и наименьшей в группе ЦсА с концентрацией 1,0 мкг/мл - 75,0±1,6 кл/мм2 (табл. 1). При высоких концентрациях ЦсА в монослое наблюдали много

свободных от клеток пространств, отростки фибробластов были укорочены (рис. 1).

Более объективным в отношении изучения антипролиферативного эффекта ЦсА было определение индекса пролиферации (IP), количества удвоений культуры (KD) и времени удвоения культуры (TD), то есть показателей, не зависящих от исходной разности в плотности клеток между культурами на начало фазы логарифмического роста и более точно отражающих динамику изменения данной конкретной культуры. В период с 1 по 3 сутки, когда культуры фибробластов теноновой капсулы человека находились в фазе логарифмического роста и наблюдалась наиболее активная пролиферация клеток, значения IP находились в обратной зависимости от дозы ЦсА в питательной среде с сильной связью по шкале Чеддока (коэффициент корреляции Спирмена 0,92). Также обнаруживали постепенное увеличение показателя TD с ростом концентрации ЦсА в пределах всего изучаемого диапазона – от 0,05 до 2,00 мкг/мл (коэффициент корреляции Спирмена 0,93). При этом время удвоения культур с добавлением ЦсА превышало данный показатель контрольной группы в 1,5-5,1 раз в зависимости от концентрации. Определение показателя KD за весь период эксперимента также показало дозозависимое уменьшение количества удвоений культуры с высокой степенью корреляции (коэффициент корреляции Спирмена 0,78). При этом в концентрации ЦсА, равной 1,00 мкг/мл, зафиксировали полное отсутствие удвоения (табл. 2). Полученные

Таблица 2

Показатели пролиферативной активности фибробластов теноновой капсулы человека,

данные свидетельствуют о наличии прямого дозозависимого антипролифератив-ного эффекта ЦсА на фибробласты теноновой капсулы человека.

культивируемых в различных концент рациях циклоспори на

Концентрация ЦсА, мкг/мл	IP, отн. ед.	TD, час	KD, отн. ед.
0,00	2,27±0,17	42,51±3,84	1,56±0,03
0,05	1,70±0,05*	63,65±3,42*	0,92±0,05*
0,20	1,50±0,04*	83,53±5,63*	0,76±0,04*
0,50	1,47±0,05*	89,82±7,72*	0,63±0,07*
1,00	1,40±0,03*	99,61±5,28*	-
2,00	1,23±0,04*	214,97±47,67*	0,64±0,06*

Примечание: *- р<0,05 в сравнении с контрольной группой. IP – индекс пролиферации с 1 по 3 сутки, KD – количество удвоений культуры с 1 по 7 сутки, TD – время удвоения культуры с 1 по 3 сутки, «-» – удвоение отсутствует.

На 7 сутки эксперимента достоверных различий в значениях ядерно-цитоплазматического соотношения (NCI) между исследуемыми культурами не наблюдали. Полученные значения колебались в пределах 0,12-0,15, что свидетельствовало о том, что все исследуемые куль- туры в данные сроки находились в стационарной фазе, а снижение плотности монослоя в культурах с добавлением ЦсА происходило за счет торможения пролиферации, а не за счет клеточной гибели (рис. 2).

Рис. 1. Фибробласты теноновой капсулы человека в присутствии различных концентраций ЦсА через 7 суток культивирования. Нативный препарат. Инвертированный микроскоп. Фазовый контраст. Ув. х100.

Рис. 2. Определение ядерно-цитоплазматического отношения фибробластов в программе CellSens Standart 1.7.

Рис. 3. Фибробласты теноновой капсулы человека в присутствии различных концентраций ЦсА на 7 сутки эксперимента. Окраска трипановым синим. Инвертированный микроскоп. Фазовый контраст. Ув.: х200.

При анализе препаратов, окрашенных трипановым синим, была отмечена тенденция к уменьшению количества клеток с поврежденными мембранами с увеличением концентрации ЦсА. При этом в концентрациях 1,0 и 2,0 мкг/мл повре- жденных клеток при данном виде окрашивания не обнаруживали. Такую закономерность можно объяснить тем, что, вероятно, действию препарата более подвержены молодые пролиферирующие клетки, которых было больше в культурах с мень- шими концентрациями препарата, чем стационарные клетки вне пролиферации. В концентрации ЦсА 1,0 мкг/мл согласно данным предыдущего этапа исследования пролиферация прекращалась. Тем не менее, во всех исследуемых концентрациях количество поврежденных клеток не превышало допустимого уровня для данного вида культуры клеток (рис. 3).

Окрашивание суданом IV и гематоксилином не выявило повреждения клеточных мембран. Морфология клеток характеризовалась как удовлетворительная: четкие границы, гомогенная цитоплазма, базофильные ядра с 2-4 ядрышками. Лишь в культуре с концентрацией ЦсА 0,5 мкг/мл обнаружили единичные фибробласты с красными липидными включениями (рис. 4).

Количественное определение доли поврежденных клеток производили при

Рис. 4. Фибробласты теноновой капсулы че- ловека в присутствии различных концентраций ЦсА на 7 сутки эксперимента. Инвертированный микроскоп. Синий указатель -делящаяся клетка. Красный указатель - клетка с липидными включениями. Окр.: суданом IV и гематоксилином. Ув.: х200.

анализе препаратов, окрашенных флуоресцентными красителями набора «Live/Dead». Наименьший показатель наблюдали в концентрациях 0,05 и 1,0 мкг/мл - 1,17±0,51% и 1,17±0,36%, соответственно, наибольший показатель - в концентрации 0,2 мкг/мл - 3,68±0,64%. В контрольной группе доля поврежденных клеток составила 3,55±0,82%. Ни в одной из исследуемых культур доля клеток с поврежденными мембранами не достигала 5% (допустимой доли поврежденных клеток в стационарной культуре). Статистически достоверной разницы с группой контроля также не было обнаружено ни в одном случае (рис. 5). При анализе окрашенных препаратов также обращало на себя внимание визуально заметное снижение плотности клеточных элементов с увеличением концентрации ЦсА (рис. 3-5).

Рис. 5. Фибробласты теноновой капсулы человека в присутствии различных концентраций ЦсА на 7 сутки эксперимента. Клетки с зеленым свечением жизнеспособны.

Клетки со светящимися красными ядрами имеют поврежденные мембраны (указатели). Люминесцентная микроскопия. Окр.: флуоресцентными красителями. Ув.: х100.

Результаты исследования подтвердили литературные данные о том, что ЦсА может оказывать непосредственное анти-пролиферативное действие на фибробласты при отсутствии выраженной цитотоксичности в изолированной культуре клеток [9,10]. При этом антипролиферативное действие препарата в отношении фибробластов теноновой капсулы человека вы- явлено впервые. Однако механизм подобного действия ЦсА до сих пор неизвестен. В нашем исследовании ЦсА достоверно снижал пролиферативную активность фибробластов теноновой капсулы человека во всех изученных концентрациях от 0,05 до 2,0 мкг/мл с полной остановкой пролиферации без нарушения жизнеспособности клеток при культивировании фибробла- стов в питательной среде с содержанием ЦсА 1,0 мкг/мл. При этом антипролифера-тивный эффект ЦсА имел дозозависимый характер, наиболее выраженный в пределах концентраций 0,05-1,0 мкг/мл, что соответствует общепринятым терапевтическим концентрациям препарата, оказывающим иммуносупрессивное действие.

В ходе данного эксперимента не обнаружено признаков цитотоксичности ЦсА в отношении фибробластов теноновой капсулы человека в пределах изученных концентраций (0,05-2,0 мкг/мл). Ни в одной из исследуемых групп количество поврежденных клеток не превышало 5% и не было достоверно выше значений, полученных для контрольных культур клеток в питательной среде без добавления лекарственных препаратов. Результаты данного этапа исследования соответствует литературным данным, согласно которым пер- вые признаки цитотоксичности ЦсА в отношении наиболее чувствительных к действию неблагоприятных факторов клеток глаза наблюдали при длительном культивировании их в концентрациях ЦсА, превышающих 5 мкг/мл, а признаки снижения жизнеспособности фибробластов конъюнктивы наблюдали при концентрациях более 10 мкг/мл.

Заключение. Таким образом, пролонгированное применение ЦсА оказывает антипролиферативный эффект на фибробласты теноновой капсулы человека в концентрациях 0,05-2,0 мкг/мл без выраженного цитотоксического эффекта. Поэтому местное применение ЦсА в хирургии глаукомы в пределах данных концентраций может быть перспективной стратегией в борьбе с послеоперационным рубцеванием.