Влияние цинксодержащего кальций-фосфатного покрытия на остеоинтеграцию чрескожных имплантатов для протезирования конечностей

Чрескожное остеоинтеграционное протезирование является развивающимся методом лечения пациентов с потерей конечностей [1, 2]. К настоящему времени параллельно с двухэтапной технологией протезирования развивается одноэтапная процедура [3, 4], требующая новых решений для улучшения остеоинтеграции имплантируемой части, т.к. проблема стабильности имплантата в условиях одноэтапного процесса является ключевой [5]. Ранее нами показано, что эффективная остеоинтеграция чрескожных имплантатов при одноэтапной процедуре может достигаться за счёт применения дополнительных фиксирующих имплантат устройств в совокупности с возможностью этих устройств обеспечивать механическую компрессию имплантата [6]. Другой вариант для реализации одностадийного ускоренного протокола остеоинтеграции — использование имплантатов типа Press-Fit [7].

Однако такие подходы являются недостаточными для оптимальной остеоинтеграции имплантатов в условиях одноэтапности процесса. Поэтому возникла необходимость разработки дополнительных технологий, стимулирующих процесс интеграции чрескожных имплантатов, в том числе за счет модификации поверхности имплантируемой части [8, 9]. Так, одним из способов повышения остеоинтеграции имплантатов является нанесение на его поверхность биоинертного оксидного или биоактивного кальций-фосфатного покрытия [10]. Среди методов нанесения покрытий на имплантаты на основе титана следует выделить метод микродугового оксидирования, который позволяет импрегнировать в состав покрытия дополнительные эссенциальные микроэлементы, обеспечивающие положительные для остеогенеза эффекты. В ряде работ продемонстрировано положительное влияние на остеоинтеграционные процессы внедрения в состав кальций-фосфатного покрытия ионов цинка, стронция и кремния [11–13].

Цель работы — оценка остеоинтеграции титановых чрескожных имплантатов с кальций-фосфатным покрытием, содержащим ионы цинка.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Изделия . В работе использованы имплантаты из сплава Ti6Al4V для протезирования культей трубчатых костей [14] (рис. 1, а). На рабочую поверхность имплантата наносили цинксодержащее кальцийфосфатное (КФ) покрытие (Zn-КФ) с помощью метода дугового оксидирования (рис. 1, б). Имплантаты изготавливали из порошка Ti6Al4V со средним размером частиц 23,5 мкм производства фирмы Advanced Powders&Coatings Inc. (Канада) методом селективного лазерного сплавления на 3D-принтере EOS EOSINT M 280 (Германия). Нанесение покрытий на имплантаты проводили на полупромышленной установке Micro-Arc 3.0.

Рис. 1. Внешний вид имплантатов: а — без нанесенного покрытия (контроль); б — с Zn-КФ покрытием (опыт)

Для нанесения покрытий имплантаты погружали в ванну с электролитом. Осаждение покрытий проводили в электролите-суспензии состава (мас. %): H 3 PO 4 — 27; CaCO 3 — 7; синтетический цинк-замещенный гидроксиапатит (Zn-ГА) (Ca 10 Zn 9 (PO 4 ) 6 (OH) 2 ) — 5; остальное — дистиллированная вода. Zn-ГА в нанокристаллическом состоянии со средним размером зерен 30–50 мкм синтезирован меха-нохимическим методом в Институте химии твердого тела и механохимии СО РАН [15]. Параметры нанесения покрытий: анодное напряжение — 200 В, длительность импульсов — 100 мкс, частота импульсов — 50 Гц, длительность обработки — 5 минут. Толщину покрытий определяли с помощью цифрового микрометра Зубр (точность измерений 1 мкм). Массу покрытий измеряли на аналитических весах CAS CAUX-220 (точность измерений 1 мг). Шероховатость поверхности определяли с помощью контактного «Профилометра-296» по параметру Ra, как среднеквадратичное отклонение профиля в пределах базовой длины. Масса сформированных на имплантатах покрытий составила (29,3 ± 2,1) мг, толщина — (33,5 ± 2,8) мкм, шероховатость Ra — (2,3 ± 0,5) мкм (рис. 1, б). Морфология, структура, состав и свойства сформированных покрытий описаны ранее [11, 13].

Все изделия для имплантации поступали в индивидуальных упаковках не стерильными. Перед применением имплантаты проходили стерилизационную обработку в сухожаровом шкафу при температуре 180 ºС в течение 1 ч. Максимальный срок хранения изделий перед применением составил 6 мес.

Дизайн исследований in vivo . Эксперимент проводили на 12 кроликах-самцах породы шиншилла в возрасте от 8 до 9 мес., средний вес кроликов — (3,4 ± 0,2) кг. Всем кроликам осуществляли удаление большеберцовой кости на границе верхней и средней трети. После чего обрабатывали сверлом костномозговой канал, вкручивали имплантат в культю большеберцовой кости. Мягкие ткани послойно ушивали внутренними швами, формировали лоскут из кожи, в котором выполняли отверстие для выхода части имплантата наружу. Далее на кость устанавливали удерживающее компрессионное устройство [16] с протезом из фторопласта. Кость подвергали компрессионной нагрузке 3,5Н в течение 5 нед. Длительность наблюдения — 26 недель. Животные разбиты на две группы: группа 1 ( n = 6) — животным имплантировали изделие без покрытия (контроль); группа 2 ( n = 6) —животным имплантировали изделие с цинк-замещенным кальций-фосфатным покрытием (основная группа). Клинический контроль осуществляли во время всего послеоперационного периода. Обращали внимание на состояние животных, термометрию, пульс, дыхание, локальный статус конечности, состояние мягких тканей, а также послеоперационных ран.

Регулирующие стандарты . Исследование выполнено в соответствии со стандартами ISO 10993-1-2021. Изделия медицинские. Оценка биологического действия медицинских изделий. Часть 1. Оценка и исследования в процессе менеджмента риска; ISO 10993-6-2021. Изделия медицинские. Оценка биологического действия медицинских изделий. Часть 6. Исследования местного действия после имплантации.

Этические принципы . Исследование проведено при соблюдении принципов гуманного обращения с лабораторными животными в соответствии с требованиями Европейской конвенции по защите позвоночных животных, используемых для экспериментов и других научных целей, и Директивой 2010/63/EU Европейского парламента и Совета Европейского союза от 22 сентября 2010 г. по охране животных, используемых в научных целях. До начала исследования получено одобрение локального этического комитета (протокол № 1 (71) от 28.04.2022).

Эвтаназия . Плановую эвтаназию животных производили после миорелаксации раствором димедрола 1 % (0,02 мг/кг) и рометара 2 % (5 мг/кг), далее вводили летальную дозу барбитуратов.

Для определения эффективности остеоинтеграции осуществляли рентгенологические, гистологические и биохимические исследования.

Рентгенологическое исследование . Для рентгенографии использовали рентгеновский аппарат Compact (Италия). Рентгенологическое исследование оперированной конечности животного выполняли в кра-ниокаудальной и латеромедиальной проекциях. Рентгенографию проводили до и после оперативного вмешательства, на 5, 12, 26 нед. после имплантации.

Гистологическое исследование . У эвтаназированных животных осуществляли послойную препарацию от мягких тканей культи большеберцовой кости с интрамедуллярно интегрированным имплантатом. Фиксацию материала проводили в 10 % растворе нейтрального формалина не менее 10 сут. Затем костно-имплантационный блок продольно распиливали, оставляя имплантат в одной из половин.

Фрагмент кости без имплантируемого изделия деминерализовывали в смеси растворов муравьиной и соляной кислот, дегидратировали в этиловом спирте. После этапов пропитки в нескольких порциях «жидкого» 5 % целлоидина заливали в густой 40 % целлоидин и уплотняли блоки в хлороформе.

Срезы готовили при помощи санного микротома Reichard (Германия) и окрашивали их гематоксилином и эозином, пикрофуксином и по методу Массона по технологии плавающих срезов. Гистологические препараты изучали с использованием стереомикроскопа AxioScope.A1, цифровые изображения получали с помощью цифровой камеры AxioCam ICc 5.

Другую часть костно-имплантационного блока культи большеберцовой кости дегидратировали, заливали в камфен и высушивали на воздухе до полной его возгонки. Высушенные препараты напыляли Pt в специальном напылителе IB-6 (EICO, Japan).

Количественное определение содержания Са и Р (W, в весовых %) в различных участках костно-имплантационных блоков выполняли методом энергодисперсионного рентгеновского микроанализа с использованием спектрометра BRUKER QUANTAX 200 – XFlash 6/10 (Bruker Nano GmbH, Германия), в комплекте со сканирующим микроскопом (СЭМ) Zeiss EVO MA18 (Carl Zeiss Group, Германия). Анализ количественных показателей осуществлялся в программе ESPRIT (Bruker Nano GmbH, Германия).

Биохимическое исследование включало определение в сыворотке крови животных концентрации общего белка, мочевины, креатинина, глюкозы, лактата, общего кальция, неорганического фосфата, калия, натрия, хлоридов, С-реактивного белка (СРБ), а также активности щелочной фосфатазы (ЩФ) и тар-тратрезистентного (костного) изофермента кислой фосфатазы (ТрКФ), креатинкиназы, трансаминаз. Исследования выполнены на автоматическом биохимическом анализаторе Hitachi/BM 902 (Италия) с использованием наборов реагентов Витал Диагностикс, Вектор-Бест (Россия).

Статистические методы исследования . Результаты в таблицах представлены в зависимости от характеристик сравниваемых выборок (нормальность оценивали по критерию Шапиро – Уилка) либо в виде среднего арифметического и стандартного отклонения (Xi ± SD), либо в виде медианы, 1–3 квартиля (Me, Q1–Q3). Процедуру статистической оценки значимости отличий показателей на сроках эксперимента с дооперационными значениями проводили с использованием W-критерия Вилкоксона. Достоверность различий между группами на сроках наблюдения оценивали с помощью непараметрического Т-критерия Манна – Уитни. Минимальный уровень значимости (р) принимали равным 0,05.

РЕЗУЛЬТАТЫ

Клинический контроль животных в послеоперационном периоде показал, что состояние у кроликов всех групп было удовлетворительным, внеплановой гибели не выявлено. В первые трое суток во всех наблюдениях определяли отеки в области культи, отмечали снижение аппетита. Динамическая функция конечности у всех животных восстанавливалась на 4–5 сутки после операции. Воспаления мягких тканей не отмечено. В течение первой недели после демонтажа специального устройства

(6 нед. после имплантации) отмечено выпадение имплантата в одном случае у животного группы 1, в опытной группе таких случаев не выявлено.

Рентгенологическое исследование показало, что у животных первой группы через 5 нед. после имплантации имелись участки резорбции на стыке кость / имплантат, у животных группы 2 эти признаки не определялись (рис. 2).

После 12 недель имплантации в обеих группах отмечены признаки остеоинтеграции, резорбцию не визуализировали, определяли незначительные периостальные наслоения в стадии компактиза-ции (рис. 3). К 26 чнед. после имплантации отмечена полная органотипическая перестройка кости в периимплантной зоне (рис. 4). Однако у животных группы 2 костные напластования были в стадии компактизации, располагались за ограничительным кольцом, что свидетельствовало об актив-

Рис. 2. Рентгенограммы через 5 недель после имплантации: а — группа 1; б — группа 2

ном костном интегративном процессе на границе кость–имплантат (рис. 4, б).

Рис. 3. Рентгенограммы через 12 недель после имплантации: а — группа 1; б — группа 2

Рис. 4. Рентгенограммы через 26 недель после имплантации: а — группа 1; б — группа 2

Таким образом, у животных группы 2 рентгенологическая картина на всех этапах эксперимента определялась наличием стабильности и отсутствием резорбции, что оценивается как положительные признаки остеоинтеграционных свойств изделия.

Гистологические исследования . В группе 1 через 26 недель эксперимента между поверхностью имплантата и костной тканью наблюдали плотный контакт, был сформирован единый костно-имплантационный блок. На всем протяжении культи кости сохранялась непрерывная компактная пластинка. Выраженных периостальных напластований не обнаруживали. В дистальной и средней частях культи большеберцовой кости отмечали врастание костной ткани в резьбовые межреберные углубления имплантата (рис. 5).

Гистоструктурная характеристика культи большеберцовой кости при интеграции имплантатов в опытной группе через 26 недель эксперимента обнаруживала в ложе культи большеберцовой кости сохранность метафизарно-эпифизарной части и непрерывную компактную пластинку, которая объединялась с поверхностью имплантата в метаэпифизарной области и в проксимальных участках диафиза с эндо-стально образованной костной тканью среднеячеистого трабекулярного строения. В дистальной части компактная пластинка плотно прилегала к имплантату. Наличие костной ткани обнаруживалось в резьбовых углублениях имплантата (рис. 6).

Рис. 5. Костно-имплантационный блок, формирующийся у животных контрольной группы к 26 неделе наблюдений: а — большеберцовая кость кролика с интрамедуллярно интегрированным имплантатом (продольный распил); б — продольный гистотопографический срез большеберцовой кости кролика после извлечения имплантата. Окраска пикрофуксином. Ув. ×1,5

Рис. 6. Костно-имплантационный блок, формирующийся у животных опытной группы к 26 неделе наблюдений: а — большеберцовая кость кролика с интрамедуллярно интегрированным имплантатом (продольный распил); б — продольный гистотопографический срез большеберцовой кости кролика после извлечения имплантата. Окраска пикрофуксином. Ув. ×1,5

Анализ количественных данных содержания остеотропных элементов показал, что через 26 недель наблюдения в субстрате формирующегося на поверхности имплантата у кроликов группы 2 элементов кальция и фосфора было достоверно больше во всех областях имплантата относительно животных группы контроля (табл. 1).

Таблица 1

Массовая доля W (Са) и W (Р) в различных участках культи большеберцовой кости (Xi ± SD)

Область исследования	Кальций, вес %		Фосфор, вес %
	Группа 1	Группа 2	Группа 1	Группа 2
Проксимальная	7,3 ± 0,4	15,1 ± 0,7*	3,6 ± 0,1	5,2 ± 0,3*
Срединная	9,1 ± 0,3	15,3 ± 0,7*	4,6 ± 0,2	5,8 ± 0,2*
Дистальная	10,3 ± 0,3	13,2 ± 0,7*	4,5 ± 0,3	5,8 ± 0,4*
Интактные животные	19,30	± 0,91	8,12 ± 0,39

Примечание : * — достоверные отличия относительно группы 1 (контроль) при р < 0,05.

Таким образом, проведенное гистологическое исследование показало, что изделие с кальций-фосфатным покрытием обладало более выраженными остеоинтегративными характеристиками в изученных группах. В дистальной части культи отмечено наползание плотной соединительной ткани на ограничивающую кольцевую конструкцию и структуры имплантата, предшествующие ей, что способствовало формированию наружного барьера и предотвращению развития внутрикостной инфекции. Отрицательным моментом является имбибиция частиц имплантата в пограничные с ним ткани.

Лабораторные исследования . Изменения активности фосфатаз и концентрации кальция и фосфатов в сыворотке крови экспериментальных животных представлены в таблице 2.

Таблица 2

Активность фосфатаз, концентрация кальция и фосфата в сыворотке крови кроликов на сроках (недели) эксперимента, Ме (Q1–Q3)

Срок	Группа	ЩФ, Е/л	ТрКФ, Е/л	Кальций, ммоль/л	Фосфат, ммоль/л
0	1	53 (48–63)	26 (22–26)	2,67 (2,61–2,70)	1,22 (1,14–1,34)
	2	54 (32–70)	28 (21–33)	2,69 (2,52–2,75)	1,34 (1,21–1,44)
3	1	42 (38–46)*	41 (35–42)*	2,78 (2,65–2,91)	1,31 (1,20–1,57)
	2	55 (47–63)^	29 (24–40)	2,75 (2,62–2,80)	1,14 (1,10–1,20)*
6	1	57 (49–69)	34 (29–38)*	2,65 (2,54–2,72)	1,34 (1,23–1,42)
	2	60 (53–65)	19 (17–21)*^	2,65 (2,60–2,71)	1,09 (1,07–1,18)*^
12	1	58 (45–66)	20 (16–28)	2,65 (2,57–2,73)	1,43 (1,42–1,45)
	2	46 (45–57)	24 (23–26)	2,51 (2,47–2,59)	1,04 (1,02–1,19)*^
26	1	61 (56–66)	20 (16–29)	2,71 (2,62–2,78)	1,39 (1,26–1,45)
	2	58 (42–63)	23 (22–28)	2,79 (2,55–2,83)	1,03 (0,98–1,14)*^

Примечание : * — различия с дооперационными (срок 0) значениями, р < 0,05; ^ — различия показателей с контрольной группой при р < 0,05.

Обнаружено, что у животных группы 1 (контроль) активность ЩФ относительно дооперационного уровня снижалась на 3 неделе после имплантации. У кроликов группы 2 повышение активности ЩФ на сроках относительно значений до операции не отмечено, но ЩФ на 3 неделе была выше относительно группы контроля. Активность ТрКФ на 3 и 6 неделях повышалась у животных группы контроля относительно исходных значений. В группе 2 отмечено достоверное снижение активности ТрКФ на 6 неделе после имплантации как относительно дооперационного уровня, так и относительно группы контроля на данном сроке. Концентрация общего кальция в сыворотке крови всех экспериментальных групп статистически значимо не изменялась как относительно дооперационных значений, так и между группами. В группе 2 на всех сроках эксперимента отмечено снижение концентрации неорганического фосфата в сыворотке крови относительно исходных значений и относительно животных группы контроля.

Отмечены значительные отличия в динамике С-реактивного белка (СРБ) (табл. 3). Так, достоверно повышенные значения СРБ в контрольной группе (группа 1) наблюдали до 26 недели эксперимента, в группе 2 — до 5 недели. В группе 2 на 26 неделе эксперимента отмечали статистически значимое снижение концентрации лактата как относительно исходных, дооперационных значений, так и относительно значений группы контроля. Другие биохимические показатели не имели достоверных отличий в обеих группах.

Таблица 3

Концентрация СРБ и лактата в сыворотке крови кроликов на сроках эксперимента, Ме (Q1–Q3)

Показатель	Группа	Сроки (недели) эксперимента
		0	3	5	12	26
СРБ, мг/мл	1	0 (0–1)	13* (6–22)	10* (4–17)	2 (0–3)	4* (2–21)
	2	0 (0–1)	6* (2–14)	6* (5–10)	3 (0–4)	0 (0–2)
Лактат, ммоль/л	1	9,5 (7,4–10,1)	10,4 (8,3–12,3)	9,0 (7,4–9,9)	8,8 (7,5–11,4)	10,5 (8,9–11,4)
	2	9,1 (7,5–10,8)	9,5 (7,8–10,2)	9,5 (8,1–10,0)	6,4 (4,9–7,8)	4,8*^ (2,7–7,5)

Примечание : * — различия с дооперационными (срок 0) значениями, р < 0,05; ^ — различия показателей с контрольной группой при р < 0,05.

ОБСУЖДЕНИЕ

Развитие технологии одноэтапной остеоинтеграции чрескожных имплантатов является перспективным методом для решения задач протезирования костей, при этом ряд работ указывает, что переход к такой процедуре способствует улучшению результатов лечения целевых пациентов [17, 18]. Развитие этого варианта технологии чрескожного остеоинтеграционного протезирования лежит в направлении повышения остеоинтеграции имплантата, обеспечивающей его стабильность, устойчивость к инфицированию и достаточную герметизацию мягких тканей вокруг внешней части имплантата [19, 20].

Учитывая имеющиеся данные, в рамках развития способов стимуляции остеоинтеграции нами оценён новый имплантат для протезирования культей трубчатых костей с модифицированной поверхностью. Обнаружено, что применение имплантата с Zn-содержащим КФ покрытием имеет признаки улучшенной интеграции в отличие от изделия без покрытия. Кроме того, имплантация изделий с кальций-фосфатным покрытием не вызывала у животных признаков отторжения, интоксикации (как локальной, так и системной), системной воспалительной реакции в течение всего срока наблюдения. Отсутствие серьезных нежелательных реакций на тестируемые изделия позволяет заключить, что все исследуемые имплантаты имели приемлемую переносимость и безопасность.

Литературные данные по оценке возможностей повышения интегративных свойств имплантатов с Zn-содержащим КФ покрытием достаточно скудны. Имеется работа, в которой также отмечается способность такого покрытия улучшать остеоинтеграцию металлических чрескожных имплантатов [21]. Тем не менее, перспективность применения такого покрытия очевидна, о чем свидетельствуют многочисленные данные по улучшенной остеоинтеграции дентальных имплантатов с КФ покрытием [22–24]. Дополнительным фактором в пользу применения изделий с КФ покрытием является то, что отдельные исследования указывают на способность таких покрытий снижать воспалительную реакцию и инфицирование зоны имплантации [25, 26].

Дальнейшее совершенствование остеоинтегративных характеристик разработанного изделия может быть связано с увеличением числа дополнительных микроэлементов в составе КФ покрытия [27, 28], применением имплантатов с быстро рассасывающимися гидрогелями, загруженными антибиотиками [29]. Интересным выглядит возможность нанесения на металлические имплантаты покрытий из биополимеров, особенно части поверхности имплантатов, интегрируемых с мягкими тканями [30], а также использование искусственных полимеров вместо титана [31, 32].

Очевидно, что полученные нами результаты имеют ограничения в части объемов выборок экспериментальных животных. Экстраполяция результатов исследования для клинической практики возможна, т.к. использованная экспериментальная модель приближена к модели клинического применения (одноэтапное протезирование), в том числе за счет достаточно длительного срока наблюдения после имплантации.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Применение имплантатов с цинк-модифицированным кальций-фосфатным покрытием обнаруживало признаки более эффективной остеоинтеграции по сравнению с изделием без дополнительного покрытия. Такие имплантаты с модифицированной КФ поверхностью в разработанном дизайне на основе полученных данных по их эффективности и безопасности могут быть применимы для задач протезирования культей мелких костей в рамках одноэтапной технологии протезирования.