Влияние дефицита эстрогенов и инъекций глюкокортикоидов на метаболизм костной ткани у животных

Большинство физиолого-биохимических процессов в органах зависят от функционального состояния соединительной ткани, которая, обладая механическими, защитными и пластическими свойствами, в конечном счете, поддерживает гомеостаз [1,2]. Поэтому главными причинами заболеваний опорно-двигательной системы являются нарушения обменных процессов в организме, сопровождающиеся деструкцией специализированного вида соединительной ткани – костной ткани. Процессы метаболизма последней обеспечиваются сложными взаимосвязанными механизмами регуляции. При снижении процессов костеобразования и усилении процессов резорбции кость подвергается атрофии, что обозначают термином «остеопороз» [3,4].

Наиболее часто встречающийся и всесторонне изучаемый сегодня тип остеопороза – постменопаузальный остеопороз, который развивается в связи с гипофункцией яичников. Вместе с этим терапия большого количества заболеваний связана с применением препаратов глюкокортикоидов, побочным эффектом такого лечения является развитие «стероидного остеопороза». За последние 20 лет достигнут значительный прогресс в представлении о патофизиологии и лечении остеопороза, это привело к пониманию того, что профилактика и терапия остеопороза являются реальной задачей [5]. При разработке новых способов лечения, особенно на доклиническом этапе исследований, необходимы адекватные модели развития резорбции костной ткани, затрагивающие разные патогенетические механизмы. Изучению таких моделей посвящено данное исследование.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Исследования проведены на беспородных половозрелых крысах-самках массой 180-290 г и самцах массой 200- 320 г.

На первом этапе эксперимента наблюдали влияние гипоэстрогенного состояния на животных. Исследования проводилось на беспородных половозрелых крысах-самках возрастом 6 месяцев и 1,5 года. Из них было сформировано 2 группы разных возрастов: группа шестимесячных крыс весом 180200 г и группа полуторагодовалых крыс весом 230280 г. Гипоэстрогенное состояние достигалось путем двусторонней овариоэктомии. Кастрация проводилась стандартным способом [6]. После овариоэктомии у животных брали влагалищные мазки каждый день в течение 7 суток. В эксперимент включали только тех крыс, у которых не было обнаружено циклических изменений во время этого периода. Срок наблюдения после овариоэктомии 2,5 мес. Контрольными группами служили интактные животные, содержавшиеся в идентичных условиях.

На втором этапе создавали гиперглюкокортикоидную модель остеопороза, для чего самцам крыс ежедневно однократно в одно и то же время вводили внутрибрюшинно гидрокортизон в дозе 40 мг/кг на протяжении 28 суток.

На каждом этапе эксперимента были выделены группы сравнения. Это контрольные группы – интактные животные, содержащиеся в идентичных с опытными условиях и не подвергавшиеся описанным выше воздействиям.

Все животные содержались в одинаковых условиях вивария на сбалансированном по жирам, углеводам, белкам и минеральным веществам питании при комнатной температуре. Для проведения биохимических исследований животных умерщвляли путем декапитации.

Для оценки метаболизма костной ткани и активности остеоиндуктивных процессов использовали общеморфологические и биохимические методы.

Объектом исследований являлись кровь, надпочечники и костная ткань животных. В экспериментах изучали содержание 11-оксикортикостероидов (11-ОКС) в надпочечниках и плазме крови по методу Панкова Ю.А., Усватовой И.Я. в модификации Подковкина В.Г. [7], связанного и свободного оксипролина в плазме крови – по методу Крель

А.А., Фурцевой Л.Н. [8]. В сыворотке крови определяли активность щелочной фосфатазы и концентрацию неорганического фосфата по методу Бодан-ского А. [9] и Са ²⁺ по методу Вишневской Т.М., Ляшевской Т.Н. [10]. Рассчитывали величину относительной массы надпочечников. Проводили биометрическое измерение бедренных костей крыс.

Препараты бедренных костей для морфологических исследований приготовляли общегистологическими методами, окрашивали гематоксилин-эозином по Ван-Гизону [11]. Исследование препаратов проводили на микроскопе МБИ-11.

Полученные в экспериментах результаты подвергали статистической обработке стандартным способом, используя t критерий Стьюдента [12], с применением компьютерных приложений Excel. Изменения исследуемых показателей считались статистически значимыми при p<0,05.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Результаты комплексных исследований показали, что у животных после инъекций глюкокортикоидов и овариоэктомии развиваются процессы резорбции костной ткани.

глюкокортикоидная модель гипоэстрогенэмия (1,5 года) гипоэстрогенэмия (6 мес)

-50

Рис. Показатели обмена коллагена у крыс при овариоэктомии и инъекциях глюкокортикоидов. 1 – свободный оксипролин, 2 – белковосвязанный оксипролин, 3 – 11-оксикортикостероиды, 4 – активность щелочной фосфатазы. * - отличие от контроля статистически значимы с доверительной вероятностью р<0,05

Отмечено уменьшение интенсивности биосинтеза коллагена, выраженное в достоверном снижении уровня одного из маркеров костного ремоделирования – белковосвязанного оксипролина – в плазме крови животных во всех моделях. Резорбция костной ткани сопровождалась повышением уровня свободного оксипролина на 50% при введении глюкокортикоидов, тогда как удаление яичников не вызывало изменений данного показателя в группе полуторагодовалых крыс. Появляющийся в крови оксипролин суммарно отражает функцию остеокластов и указывает на усиление резорбции костной ткани. Такие изменения связаны с преобладанием распада коллагена над его синтезом.

Помимо маркеров коллагенового обмена о перестройках костной ткани позволяют судить изменения активности щелочной фосфатазы. Активность общей щелочной фосфатазы – показатель процесса формирования кости. В его основе после овариоэктомии лежит дефицит эстрогенов, который первично влечет за собой активизацию процесса резорбции кости, с вторичным усилением процесса формирования кости вследствие спаренности обоих процессов.

Активность щелочной фосфатазы достоверно снижалась на 35 и 28 % при гиперглюкокортикоидном состоянии и при гипоэстрогенемии соответственно.

Процессы разрежения костной ткани сопровождались активизацией функции коры надпочечников у животных при гипоэстрогенемии (компенсаторное включение коры надпочечников при дефиците эстрогенов), что имеет важное значение, поскольку стероидный остеопороз развивается в результате воздействия избыточного количества глюкокортикоидов на костную ткань, вызывая активацию остеокластов. Это особенно важно в условиях дефицита эстрогенов, активирующих работу остеобластов. Зафиксировано значительное увеличение концентрации 11-ОКС в тканях этих желез.

При введении экзогенных стероидов в надпочечниках уровень гормонов не отличался от показателя контрольной группы, что можно объяснить действием адренокортикотропного гормона по принципу отрицательной обратной связи и снижением синтеза эндогенных стероидов в надпочечниках в ответ на введение экзогенных гормонов (отмечено значительное увеличение концентрации 11-ОКС в плазме).

Уровни кальция и неорганического фосфата находились в основном в пределах физиологической нормы, что можно объяснить действием механизмов фосфорно-кальциевого гомеостаза. Однако в пределах физиологической нормы наблюдалось увеличение содержания кальция в сыворотке крови в группе полуторагодовалых крыс с удаленными яичниками. В группе шестимесячных крыс опытное значение не отличается от контроля.

При развитии первичного остеопороза уровень кальция должен быть в пределах нормы [2,13], что наблюдается в группе молодых крыс. Но в соответствии с литературными данными о гиперкальциемии при постменопаузальном остеопорозе [14] можно заключить, что у полуторагодовалых крыс после удаления яичников происходит увеличение костного обмена, а вследствие этого и резорбции костной ткани.

При изучении биометрического показателя отношения массы бедренной кости к диаметру диафиза установлено, что воздействие гиперглюкокортикоидного и эстрогендефицитного состояний приводило к снижению костной массы в единице объема, что согласуется с данными, полученными ранее при изучении гипертермических состояний у экспериментальных животных [15].

При анализе морфологических данных выявлено, что в метэпифизарных зонах бедренных костей выявлены характерные для остеопороза признаки: мало перегородок, истончение, разволокнение и разрушение костных балок спонгиозы, их фрагментация, неровные с нишами резорбции поверхности костных трабекул, в которых обнаруживаются многоядерные остеокласты. Таким образом, результаты морфологических исследований подтверждают биохимические данные о развитии процессов остеорезорбции, выраженной в обеих экспериментальных моделях.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Исследованные способы получения остеорезорбции (эстрогенодефицитное и гиперглюкокортикоидное состояния) отвечают поставленным требованиям. Тем не менее, к недостаткам моделей следует отнести трудоемкость методов (выполнение операций, ежедневное взятие мазков, инъекции гормонов на протяжении 28 суток) и длительность исследований (животных выводят из эксперимента через 3 и более месяцев). Однако патогенез и степень выраженности процессов резорбции, подтверждающиеся биохимическими и морфологическими данными, дают несомненное преимущество гипоэстрогенной и гперглюкокортикоидной моделей перед другими, и их следует рекомендовать для доклинических этапов исследований при изучении новых способов лечения остеопороза.