ВЛИЯНИЕ ДЛИНЫ ВОЛНЫ СВЕТА НА ЧУВСТВИТЕЛЬНОСТЬ РЕФРАКТОМЕТРИЧЕСКОГО ДЕТЕКТОРА ДЛЯ ВЭЖХ

Проведены исследования чувствительности рефрактометрического детектора для ВЭЖХ с кварцевой кюветой с двумя и тремя сквозными каналами при ширине диафрагмы 50, 75, 100 мкм и длине волны света от источников: лазерного модуля λ = 650 нм, светодиодов λ = 430–520 нм и λ = 610–760 нм, вольфрамовой нити накала с фильтром λ = 450–530 нм. Показано, что разработанный для ВЭЖХ рефрактометрический детектор с лазерным модулем, кварцевой кюветой с тремя сквозными каналами, при ширине диафрагмы 75 мкм и c хроматографическим трактом из фторопласта с оптической схемой повышает чувствительность определения органических и неорганических соединений по сравнению с прототипом в 6–7 раз, аналогом — в 16–17 раз.

Кл. сл. : ВЭЖХ, рефрактометрический детектор, кварцевая кювета, лазерный модуль, светодиодный модуль, лампочка, вольфрамовая нить

ВВЕДЕНИЕ                  диаметром 3 мм) по сравнению с полихроматиче ским световым потоком от источников: светодио-

В высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) применяются детекторы нескольких типов, включая фотометрические, электрохимические и рефрактометрические. Рефрактометрические детекторы (РД) наиболее универсальные: они позволяют детектировать органические и неорганические вещества, и принцип их действия основан на сравнении показателей преломления чистого растворителя и раствора детектируемого вещества [1–3].

К РД для ВЭЖХ предъявляются следующие требования: высокая чувствительность, широкий диапазон линейности, низкий уровень шума и особенно дрейфа нулевой линии; к конструкции кварцевой кюветы — небольшой детектируемый объем (3–10 мкл), исключение сорбции определяемых соединений хроматографическим трактом детектора. При анализе реакционных органических и неорганических соединений должно быть отсутствие контакта соединений и элюента с металлическими поверхностями хроматографического тракта детектора [1–3].

ОБСУЖДАЕМАЯ ПРОБЛЕМА

Цель работы — изучить влияние длины волны света и ширины диафрагмы на чувствительность РД с кварцевой кюветой с двумя и тремя сквозными каналами для ВЭЖХ.

Конкретно: выявить преимущества РД с источником монохроматического светового потока [1] от лазерного модуля (λ = 650 нм, 1 мВт, точка дов (λ = 430–520 нм, λ = 610–760 нм) и лампочки с вольфрамовой нитью накала (с фильтром λ = = 450–530 нм) в повышении чувствительности РД с кварцевой кюветой с тремя сквозными каналами при ширине диафрагмы 50, 75 и 100 мкм.

ЭКСПЕРИМЕНТ

Для анализа реакционных органических и неорганических соединений методом ВЭЖХ разработаны РД, в которых крепление кварцевой кюветы и жидкостный тракт выполнены из фторопласта [1–3].

Для устранения конструктивных недостатков прототипа [2] и аналога [4] разработан для ВЭЖХ высокочувствительный РД с лазерным модулем ( λ = 650 нм, 1 мВт, точка диаметром 3 мм), кварцевой кюветой с тремя сквозными каналами и хроматографическим трактом из фторопласта [1], имеющий такую оптическую схему, которая повышает чувствительность определения органических и неорганических соединений по сравнению с прототипом в 6–7 раз [2], аналогом — в 16– 17 раз [4] и обеспечивает проведение анализа при температуре аналитической колонки и оптикомеханического блока детектора 20–50 °С (рис. 1).

РД [1] содержит (рис. 1) оптически связанные источник светового потока от лазерного модуля ( λ = 650 нм, 1 мВт, точка диаметром 3 мм); объектив; щелевую диафрагму для формирования полоски света вдоль оси каналов кюветы; кварцевую

а

б

Рис. 1. Оптико-механический блок РД (виды а, б).

1 — лазерный модуль (15 × 8 мм, 3 В, 1 мВт, λ = 650 нм); 2 — объектив; 3–5 — линзы объектива; 6 — диафрагма в виде щели шириной 75 мкм; 7 — проточная кварцевая кювета с тремя сквозными каналами (7', 7", 7'") крепится между пластинами из фторопласта в корпусе кюветы 8 с помощью крышки 9 и четырех винтов 10; 11–13 — каналы для крепления капилляров из фторопласта в нижней части корпуса кюветы; 14–16 — каналы для крепления капилляров из фторопласта в верхней части корпуса кюветы; 17 — призма для юстировки детектора по эталонным веществам; 18 — плоскопараллельная кварцевая пластина зануления; 19 — фотодиод с двумя фоточувствительными площадками; 20, 21 — патрубки теплообменника

кювету с последовательно расположенными отдельными тремя сквозными каналами, треугольными в поперечном сечении с острым углом 45°; призму в виде равнобедренной трапеции с острыми углами 45° для поворота на 180° луча света, прошедшего через кварцевую кювету, и его перемещения перпендикулярно оптической оси кюветы по площадкам фотодиода при юстировке детектора по эталонным веществам; плоскопараллельную кварцевую пластину зануления; двухплощадочный фотодиод, установленный перпендикулярно оптической оси кварцевой кюветы.

В кварцевой кювете три сквозные канала (рис. 1): 7' — аналитический канал, 7" и 7'" — каналы сравнения. В кварцевой кювете с тремя сквозными каналами независимо от показателя преломления элюента и температуры направление света на выходе проточной кюветы остается на одной оптической оси с направлением света на входе кюветы. Таким образом, независимо от температурных условий анализа, окружающих детектор, нулевая линия на хроматограмме остается стабильной.

При прохождении анализируемого вещества через аналитический канал кварцевой кюветы РД направление света на выходе кюветы отклоняется от направления главной оптической оси на угол, пропорциональный изменению показателя преломления. Энергетическое равновесие на фото-чувствительных площадках фотодиода нарушается пропорционально изменению угла отклонения от оптической оси детектора, и соответственно также пропорционально изменяется измеряемый ток с фотодиода.

При прохождении светового потока от лазерного модуля через кварцевую кювету с тремя сквозными каналами компенсируется коэффициент преломления подвижной фазы, что снимает ограничения в ВЭЖХ по применению подвижных фаз, которые имеют коэффициент преломления выше определяемых органических и неорганических веществ.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Обсуждение результатов по разработке РД для ВЭЖХ в безметаллическом исполнении хроматографического тракта и чувствительности детектора с кварцевой кюветой с двумя и тремя сквозными каналами при использовании монохроматического и полихроматического световых потоков показали следующие результаты по чувствительности РД при анализе водных растворов глюкозы и хлористого калия.

В табл. 1 приведены анализы водных растворов глюкозы и хлористого калия на жидкостном хроматографе, в котором хроматографический тракт выполнен в безметаллическом исполнении. Жидкостный хроматограф включал рефрактометрический детектор RIDK-102 фирмы Laboratorni pri-stroje Praha (Чехословакия) [2] (прототип) с жидкостным трактом из фторопласта с проточной кварцевой кюветой с двумя сквозными каналами, диафрагму шириной 75 мкм [2] и лампочки с вольфрамовой нитью накала (6 В, 6 Вт). Свет от лампочки проходит через фильтр из стекла синего цвета λ = 450–530 нм. Насос фирмы "Knauer" (Германия) с жидкостным трактом из капилляров (внутр. ∅ 0.25 мм) из полиэфирэфиркетона (ПИИК), и инжектор выполнен из ПИИК и фторопласта. Результаты анализа приведены в табл. 1.

Условия измерений: анализ проб 0.2 % водных растворов глюкозы и хлористого калия проводили без колонки; инжектор с дозирующей петлей из ПИИК объемом 10 мкл; скорость элюента (дистиллированной воды) — 0.1 мл/мин; температура колонки, инжектора, РД — 20 °С; сигналы РД записывали через интерфейс с помощью компьютерной программы "Экохром".

Из табл. 1 следует, что при использовании в РД лампочки с вольфрамовой нитью накала и фильтра λ = 450–530 нм и ширине диафрагмы 75 мкм высота хроматографического пика глюкозы — 636 мВ и хлористого калия — 883 мВ и по сравнению с кварцевой кюветой с тремя сквозными каналами меньше в 2.3 раза (табл. 2).

В табл. 2 приведены анализы водных растворов глюкозы и хлористого калия на жидкостном хроматографе с РД с лазерным модулем, светодиодным модулем, лампочкой с вольфрамовой нитью накала, кварцевой кюветой с тремя сквозными каналами и при ширине диафрагмы 50, 75 и 100 мкм. Условия анализа — в табл. 1.

Из табл. 2 следует, что РД с лазерным модулем ( λ = 650 нм), кварцевой кюветой с тремя сквозными каналами и шириной диафрагмы 75 мкм обеспечивает высокую чувствительность анализа: высота хроматографического пика глюкозы — 4060 мВ, хлористого калия — 6460 мВ, и по сравнению с прототипом — РД с лампочкой с вольфрамовой нитью накала ( λ = 450–530 нм) и кварцевой кюветой с двумя сквозными каналами (табл. 1) — высота хроматографического пика глюкозы больше в 6 раз и хлористого калия — в 7 раз.

Табл. 1. Результаты анализа водных растворов глюкозы и хлористого калия при расходе элюента — дистиллированной воды — 0.1 мл/мин и детектировании РД RIDK 102 с кварцевой кюветой с двумя сквозными каналами и источнике света — лампочке с вольфрамовой нитью накала^* [2]

Источник светового потока	Ширина диафрагм., мкм	Высота пика, мВ. Делитель сигнала — 1
		Проба: 10 мкл 0.2 % водного раствора
		глюкозы	хлористого калия
Лампочка с вольфрамовой нитью	75	636	883
накала, 6 В, 6 Вт и синим фильтром	50	353	412
λ = 450–530 нм	100	225	437

Примечание: ^*РД юстирован по дистиллированной воде.

Табл. 2. Результаты анализа водных растворов глюкозы и хлористого калия при расходе элюента — дистиллированной воды — 0.1 мл/мин и детектировании РД с лазерным модулем^*, светодиодным модулем, лампочкой с вольфрамовой нитью накала, в кварцевой кювете с тремя сквозными каналами и при ширине диафрагмы 50, 75 и 100 мкм

Источник светового потока	Ширина диафрагмы, мкм	Высота пика, мВ. Делитель сигнала — 1
		Проба: 10 мкл 0.2 % водного раствора
		глюкозы	хлористого калия
	75	4060	6460
Лазерный модуль, λ = 650 нм, 3 В, 1 мВт, точка диаметром 3 мм	50	1725	2160
	100	2940	4570
Светодиод, 12 В, диаметр светоиз-	75	1275	1780
лучающей площадки 850 мкм, λ =	50	690	1055
= 430–520 нм с максимумом 460 нм	100	850	1280
Лампочка с вольфрамовой нитью,	75	1480	2020
6 В, 6 Вт, и синим фильтром	50	1070	1820
λ = 450–530 нм	100	660	920
Светодиод, диаметр светоизлучаю-
щей площадки 30 мкм, λ = 610– 760 нм с максимумом 650 нм**	1200	255	390

Примечание: ^*РД юстирован по дистиллированной воде.

**Аналог — РД фирмы "Хромдетект" не содержит призмы для юстировки [4].

РД с лазерным модулем ( λ = 650 нм), кварцевой кюветой с тремя сквозными каналами и при ширине диафрагмы 75 мкм детектирует глюкозу и хлористый калий в виде симметричных пиков, и их высота по сравнению с аналогом — РД на светодиоде со светоизлучающей площадкой Ø 30 мкм (λ = 610—760 нм) и шириной диафрагмы 1200 мкм выше по глюкозе в 16 раз и хлористому калию в 17 раз.

В РД с лазерным модулем ( λ = 650 нм) излучается монохроматический световой поток, и при прохождении через диафрагму, кварцевую кювету с тремя сквозными каналами не увеличивается его ширина на фотодиоде РД, и при ширине диафрагмы 75 мкм повышается чувствительность РД в 1.4–3 раза при анализе глюкозы и хлористого калия по сравнению с шириной диафрагмы 50 и 100 мкм.

РД с лампочкой с вольфрамовой нитью накала (λ = 450–530 нм) и светодиодным модулем (λ = 430–520 нм с максимумом 460 нм) излучают полихроматический световой поток, прохождение которого через диафрагму (ширина 75 мкм) и кварцевую кювету с тремя сквозными каналами приводит к увеличению ширины светового потока на фотодиоде РД, вследствие чего происходит детектирование глюкозы и хлористого калия в виде несимметричных пиков и понижение чувствительности РД.

Динамический диапазон детектирования при анализе водных растворов глюкозы и хлористого калия на РД с лазерным модулем и с кварцевой кюветой с тремя сквозными каналами [1] иллюстрирован графиками на рис. 2.

Из графика следует, что содержание в пробах глюкозы 5–60 мкг РД детектируется в линейном диапазоне, а при содержании в пробах глюкозы 70–90 мкг детектируется в нелинейном диапазоне. При содержании хлористого калия в пробах 5– 40 мкг РД детектируют в линейном диапазоне, а при содержании в пробах хлористого калия 50– 90 мкг детектируют в нелинейном диапазоне.

В табл. 3 приведены анализы водных растворов глюкозы и хлористого калия на жидкостном хроматографе с РД с лазерным модулем ( λ = 650 нм), кварцевой кюветой с тремя сквозными каналами и при ширине диафрагмы 75 мкм. Условия анализа: пробы — 0.2 % водные растворы глюкозы и хлористого калия; колонка из стекла (150 × 3 мм) с полидивинилбензольным (ПДВБ) сорбентом (фракции 10 мкм, размер пор 500 Å), приготовленная в соответствии с [5]; элюент — дистиллированная вода, 0.3 мл/мин; инжектор с дозирующей петлей из ПИИК объемом 10 мкл; температура

1 — хлористый калий          2 — глюкоза

Аппроксимация:                Аппроксимация:

y = 0.0399 x ² + 8.0109 x – 33.286    y = 0.0282 x ² + 6.8242 x – 18.095

Рис. 2. Динамический диапазон детектирования хлористого калия и глюкозы рефрактометрическим детектором с кварцевой кюветой с тремя сквозными каналами, лазерным модулем и жидкостым трактом из фторопласта при ширине диафрагмы 75 мкм и расходе дистиллированной воды 0.08 мл/мин. Объем дозирующей петли 10 мкл колонки, инжектора, РД — 20 и 50 ºС; сигналы детектора записывали через интерфейс с помощью компьютерной программы "Экохром".

Из табл. 3 следует, что при анализе методом ВЭЖХ на колонке с ПДВБ-сорбентом (фр. 10 мкм) водных растворов глюкозы и хлористого калия при температуре 20 и 50 °С и детектировании РД с лазерным модулем и кварцевой кюветой с тремя сквозными каналами при ширине диафрагмы 75 мкм минимально детектируемое количество глюкозы — 25 нг, хлористого калия — 15 нг.

В РД [1] два канала (7", 7'" на рис. 1) кварцевой кюветы являются сравнительными, которые компенсируют шум нулевой линии и обеспечивают высокую чувствительность РД с лазерным модулем при анализе водных растворов глюкозы и хлористого калия (табл. 3).

ОБОБЩЕНИЕ ПО ПУБЛИКАЦИЯМ

В [6–14] приведены определение молекулярномассового распределения (ММР) полимерных молекул хитозана, содержания хитозан-хитиновых полимерных молекул и хитозан-белкового комплекса в препаратах хитозана, ММР олигоэтоксисилоксанов в этилсиликатах и полимерных молекул кремниевой кислоты в геотермальной воде методом ВЭЖХ на колонке из стекла (150 × 3 мм) с ПДВБ-сорбентом (фр. 5, 10 мкм) [5] и при детектировании РД с лампочкой с вольфрамовой

Табл. 3. Результаты анализа на колонке из стекла (150 × 3 мм) с ПДВБ-сорбентом (фр. 10 мкм) водных растворов глюкозы и хлористого калия при детектировании РД с лазерным модулем ( λ = 650 нм,1 мВт, точка диаметром 3 мм ), с кварцевой кюветой с тремя сквозными каналами, при ширине диафрагмы 75 мкм^*

Наименование пробы	Элюент: дистил. вода, мл/мин	Температура анализа, °С	Детектируемое количество, нг	Высота пика, мВ	Дрейф нулевой линии за 1 ч, %
1.5 мкл 0.01 % водного раствора глюкозы	0.3	20	25	5	0.1
2.5 мкл 0.01 % водного раствора хлористого калия	0.3	20	15	5	0.1
1.5 мкл 0.01 % водного раствора глюкозы	0.3	50	25	5	0.3
2.5 мкл 0.01 % водного раствора хлористого калия	0.3	50	15	5	0.3

Примечание: ^*РД юстирован по дистиллированной воде.

нитью накала при длине волны света λ = 450– 530 нм, c кварцевой кюветой с двумя сквозными каналами (диафрагма 75 мкм) и хроматографическим трактом из фторопласта [2].

В [14–17] приведены определение ММР полимерных молекул хитозана, содержания хитозанхитиновых полимерных молекул и хитозан-белкового комплекса в препаратах хитозана, разделение гидратированных молекул сульфата и гидратированных молекул этанола методом ВЭЖХ на колонке из стекла (150 × 3 мм) с ПДВБ-сорбентом (фр. 10 мкм) [5] и при детектировании РД с лазерным модулем ( λ = 650 нм), кварцевой кюветой с тремя сквозными каналами, при ширине диафрагмы 75 мкм и хроматографическим трактом из фторопласта [1].

Для высокоэффективных колонок из стекла (150 × 3 мм) с ПДВБ-сорбентом в виде моносфе-рических зерен диаметром 5 и 10 мкм с размером пор 500 Å, приготовленных в соответствии с [5], характерны следующие процессы:

• •    элюирование из колонки в водном растворе уксусной кислоты полимерных молекул хитозана, хи-тозан-хитина, их комплексов с металлами Si, Ti, Mn, Fe, Co, Cu, Sr и хитозан-белкового комплекса осуществляется в режиме критической ВЭЖХ по эксклюзионному механизму и по смешанному сорбционно-эксклюзионному механизму [8, 10, 12–15];

• •    элюирование из колонки в абсолютном этаноле олигомеров гидролизованного и негидролизованного этилсиликата протекает в режиме критической ВЭЖХ по эксклюзионному механизму [6, 7, 10, 11];

• •    элюирование из колонки дистиллированной водой олигомеров и полимеров кремниевой кислоты протекает по эксклюзионному механизму, а мономерной кремниевой кислоты и борной кислоты — по сорбционному механизму [9, 10];

• •    элюирование из колонки в водном растворе ацетонитрила (40 об. %) гидратированных молекул сульфата натрия в виде двух хроматографических пиков протекает в режиме критической ВЭЖХ по эксклюзионному механизму [16];

• •    элюирование из колонки в ацетонитриле гидратированных молекул этанола в виде двух хроматографических пиков протекает по эксклюзионному механизму [17].

В [18] приведено определение полиароматиче-ских соединений в дизельном топливе методом ВЭЖХ на колонке из нержавеющей стали (100 × 2.1 мм) с гиперкарбом при детектировании РД с лазерным модулем ( λ = 650 нм) и кварцевой кювете с тремя каналами [1]. Оно имеет ряд преимуществ по сравнению с методикой ВЭЖХ по ГОСТ [19]: чувствительность анализа по поли-ароматическим соединениям повышается в 40 раз; расход элюента уменьшается в 10 раз и составляет (через колонку) 0.1 мл/мин; время анализа сокращается в 2.5 раза и составляет 16 мин.

В [20] приведены метрологические характеристики РД с лазерным модулем ( λ = 650 нм) и кварцевой кюветой с тремя каналами [1]. Результаты анализа водных растворов глюкозы и хлористого калия даны в табл. 4.

Табл. 4. Метрологические характеристики РД с лазерным модулем ( λ = 650 нм, 1 мВт, точка диаметром 3 мм), кварцевой кюветой с тремя сквозными каналами, при ширине диафрагмы 75 мкм, температуре детектора 20 º С при анализе водных растворов глюкозы и хлористого калия [20]^*

Наименование пробы	Элюент: дистил. вода, мл/мин	Детектируемое количество, нг	Делитель сигнала — 1		Средний квадратичный шум / средний шум нулевой линии, мВ	Соотношение сигнал / шум
			Высота хро-матографиче-ского пика, мВ	Площадь хроматографического пика, мВ ∙с
5 мкл 0.001 % водного раствора глюкозы	0.08	50	53.5	1060	2.53/2.07	21.2
2 мкл 0.001 % водного раствора глюкозы	0.08	20	21.4	424	2.53/2.07	8.5
3 мкл 0.001 % водного раствора хлористого калия	0.08	30	40.2	632	2.53/2.07	15.9
1 мкл 0.001 % водного раствора хлористого калия	0.08	10	13.4	211	2.53/2.07	5.3

Примечание: ^*РД юстирован по дистиллированной воде. Насос шприцевой. Запись и обработка хроматографических данных с РД на компьютере проводилась с помощью программы "Экохром".

Из табл. 4 следует, что при анализе водных растворов глюкозы и хлористого калия и детектировании РД с лазерным модулем, кварцевой кюветой с тремя сквозными каналами при анализе глюкозы 50 и 20 нг, хлористого калия 30 и 10 нг соотношение сигнал/шум составляет для глюкозы 21.2 и 8.5 и соответственно для хлористого калия 15.9 и 5.3. Дрейф нулевой линии РД за 1 час измерений — 0.1 %.

В РД с лазерным модулем [1] два канала в кварцевой кювете являются сравнительными, которые компенсируют шум нулевой линии и обеспечивают высокую чувствительность РД при анализе органических и неорганических соединений.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Проведенные исследования показали, что чувствительность РД зависит от длины волны света, ширины диафрагмы и конструкции кварцевой кюветы. Для анализа органических и неорганических соединений методом ВЭЖХ разработан высокочувствительный РД с лазерным модулем ( λ = = 650 нм), кварцевой кюветой с тремя сквозными каналами и жидкостным трактом из фторопласта [1]. Чувствительность РД [1] повышена по сравнению с прототипом в 6–7 раз [2], аналогом — в 16– 17 раз [4] и обеспечивает проведение анализа методом ВЭЖХ при температуре аналитической колонки и оптико-механического блока детектора 20–50 °С.