Влияние длительного кормления диспергированной пищей на цитометрические параметры печени белых крыс в онтогенезе

Введение. Одной из фундаментальных задач биологии является изучение процессов морфогенеза органов и систем органов животных в условиях нормы и патологии. Онтогенез и филогенез пищеварительной системы тесно взаимосвязаны со средой обитания и пищевой специализацией животных [1]. Характер потребляемой пищи, её состав могут оказывать влияние на развитие органов пищеварения. В современной литературе имеется множество публикаций, посвященных изучению влияния химического состава пищи, а именно соотношения её макро- и микронутриентов, пищевых волокон, на функционирование и строение печени [2–4]. Однако характер воздействия механических свойств потребляемой пищи на постнатальный морфогенез печени остается практически не изученным, в то время как уже показано влияние питания дис- пергированной (тщательно механически измельченной) пищи на онтогенез ряда органов пищеварительной системы [5–7]. С учетом тесной интеграции всех органов пищеварительного тракта весьма вероятным представляется воздействие питания диспергированной пищей на строение и функционирование печени. Особенно интересным представляется процесс адаптации печени животных, питающихся диспергированной пищей на ранних этапах онтогенеза, к питанию кормом с неизмененными механическими свойствами.

Цель исследования. Изучение влияния длительного питания мелко измельченной пищей на динамику цитометрических параметров гепатоцитов белых крыс в постнатальном онтогенезе.

Материалы и методы. Исследование проводилось на 100 самцах белых неинбред- ных крыс, которые на 21-е сут постнатального онтогенеза были произвольно разделены на три группы: контрольную (контроль) и две опытные (опыт I и опыт II) (рис. 1).

Животные контрольной группы (41 особь) с 21-х по 240-е сут постнатального онтогенеза питались естественной для грызунов пищей, основу которой составляли цельные зерна злаков и подсолнечника, крупно нарезанные овощи. Рацион питания составлялся с учетом пищевой ценности и сбалансированности всех его компонентов. Животные первой опытной группы (41 самец) с 21-х по 240-е сут постна- тального онтогенеза получали пищу того же количественного состава, но после тщательного механического измельчения (дисперга-ции). Для оценки адаптивных возможностей печени животные второй опытной группы (18 особей) с 21-х по 120-е сут постнатального онтогенеза содержались на питании диспергированной пищей, а затем со 120-х по 240-е сут постнатального периода были переведены на питание кормом, применяющимся для кормления контрольных животных. Животным обеспечивался свободный доступ к воде и пище в любое время суток.

Рис. 1. Дизайн эксперимента (* – количество животных, выведенных из эксперимента в данном возрастном периоде)

Fig. 1. Experiment design

(* – the number of animals withdrawn from the experiment at a given period)

Другие условия были идентичными. Содержание животных в виварии проводилось в соответствии с «Санитарными правилами по устройству, оборудованию и содержанию экспериментально-биологических клиник» от 6.04.1973 и приказом Минздрава России от 1.04.2016 № 199н «Об утверждении правил надлежащей лабораторной практики».

Непосредственным объектом исследования послужила печень, участки которой брали у контрольных и опытных животных (опыт I) на 21-е (поздний молочный период), 60-е (ранний пубертатный период), 120-е (поздний пубертатный период), 180-е (репродуктивный период), 240-е сут (период возмужания) [8]. Животные второй опытной группы (опыт II) выводились из эксперимента только на 180-е и 240-е сут (рис. 1). Все болезненные манипуляции с животными проводились в соответствии с приказом Минздрава СССР от 12.08.1977 № 755 «О гуманном обращении с экспериментальными животными», а также положениями Хельсинкской декларации Всемирной медицинской ассоциации от 1964 г., дополненной в 2013 г.

Для гистологического исследования кусочки печени размером 5–7 мм фиксировали в 10 % нейтральном формалине, после чего их заливали в парафин. Срезы толщиной 5 мкм окрашивали гематоксилин-эозином [9]. Морфометрию структур печени проводили с помощью компьютерной видео-тест-системы, включающей световой микроскоп Carl Zeiss, цифровую фотокамеру Canon и компьютерную программу денситофотометрии Mecos-C1. В процессе изучения гистопрепаратов измеряли площадь сечения (мкм2) ядер и цитоплазмы гепатоцитов, для оценки функциональной активности гепатоцитов определяли их ядерно-цитоплазматическое отношение (%). Для подсчета количества гепатоцитов на стандартной площади среза применяли квадратносетчатую окулярную вставку, подсчет производили при 280-кратном увеличении на площади 10 000 мкм2 [10].

Полученные морфометрические данные подвергали статистическому анализу, применяя критерий Стьюдента t (р<0,05), с помощью лицензионных компьютерных программ обработки статистических данных SPSS 13.0 for Windows, Statistica 6 (USA, Statsoft. Inc.).

Результаты и обсуждение. Динамика изменения размеров ядер гепатоцитов белых крыс контрольной и опытной групп в постнатальном онтогенезе характеризуется неравномерным увеличением. В период с 21-х по 120-е сут постнатального онтогенеза наблюдается наиболее интенсивный рост площади сечения ядер гепатоцитов контрольных и опытных животных (табл. 1). В последующий период, со 120-х по 180-е сут, отмечается некоторое уменьшение размеров ядер в обеих экспериментальных группах. Однако затем тенденция к увеличению возобновляется, и в период со 180-х по 240-е сут постнатального развития отмечается некоторое возрастание (р<0,05) размеров ядер гепатоцитов как контрольных, так и опытных животных: до 39,23±0,13 и 39,29±0,14 мкм² соответственно. При этом показатели площади сечения ядер гепатоцитов 60-, 120-, 180-суточных опытных животных оказываются статистически значимо меньше (р<0,05) аналогичных показателей контрольных животных, тогда как со 180-х по 240-е сут это различие утрачивается и размеры ядер гепатоцитов опытных животных достигают размеров ядер гепатоцитов животных контрольной группы.

Динамика изменения размеров цитоплазмы гепатоцитов животных контрольной группы в постнатальном онтогенезе также характеризуется неравномерным ростом: от позднего молочного до репродуктивного периода постнатального онтогенеза наблюдается постепенное возрастание размеров цитоплазмы гепатоцитов. В этот период отмечается увеличение площади сечения цитоплазмы с 105,25±0,48 до 225,45±0,93 мкм2 (р<0,05). Следующим периодом изменений размеров цитоплазмы в постнатальном онтогенезе является период от репродуктивного до зрелого возраста, который характеризуется уменьшением (р<0,05) площади сечения цитоплазмы гепатоцитов до 217,48±0,89 мкм2. В опытной группе животных наблюдается постепенное возрастание площади сечения цитоплазмы гепатоцитов от позднего молочного до зрелого возраста. При этом на 60-е сут (ранний пубертатный период) размер цитоплазмы гепатоцитов животных опытной группы (179,40±1,26 мкм2) превосходит (р<0,05) аналогичный показатель контрольной группы (171,33±1,40 мкм2 ), тогда как в последующие возрастные периоды площадь сечения цитоплазмы гепатоцитов животных, питающихся диспергированной пищей, оказывается меньше соответствующих контрольных значений (р<0,05).

Отношение площади ядра клетки к площади её цитоплазмы, т.е. ядерно-цитоплазма-тическое отношение (ЯЦО), является важным показателем, указывающим на интенсивность роста, развития клетки и протекания процессов жизнедеятельности [11, 12]. Наиболее высокое значение ЯЦО наблюдается у 21-суточных животных (22,94±0,11 %), что обусловлено относительно небольшими размерами цитоплазмы и крупными размерами ядра и свидетельствует о низком уровне протекания синтетических процессов. У контрольных животных к 180-суточному возрасту значение ЯЦО снижается (17,38±0,08 %, р<0,05), что связано с увеличением площади сечения цитоплазмы гепатоцитов. Это указывает на завершение роста и развития клетки, установление интенсивного, свойственного взрослому организму уровня синтетических процессов. В последующий период (180–240-е сут) значения

ЯЦО гепатоцитов несколько возрастают (18,30±0,08 %, р<0,05), так как возрастают размеры ядра при неизменных размерах цитоплазмы. В группе опытных животных ЯЦО снижается неравномерно. Наиболее интенсивное уменьшение ЯЦО наблюдается с 21-х по 60-е сут постнатального онтогенеза. Площадь сечения цитоплазмы гепатоцитов этой группы опытных животных возрастает более интенсивно по сравнению с контрольными, поэтому значения ЯЦО оказываются ниже (19,62±0,12 %, р<0,05) соответствующего значения контрольных животных того же возраста.

Таблица 1

Table 1

Цитоморфологические характеристики гепатоцитов белых крыс в норме (контроль) и при питании диспергированной пищей (опыт I, опыт II)

Cytomorphological characteristics of white rats’ hepatocytes in norm (control) and when fed with homogenized food (experiment I, experiment II)

Показатель Parameter	Группа Group	Возраст Age
		21-суточные 21-day old	60-суточные 60-day old	120-суточные 120-day old	180-суточные 180-day old	240-суточные 240-day old
Площадь сечения ядра, мкм 2 Nucleus section area, 2 μm 2	Контроль Control	23,45±0,09	37,08±0,26 +	40,58±0,15 +	38,05±0,14 +	39,23±0,13 +
	Опыт I Experiment I	23,45±0,09	34,75±0,23 +*	39,09±0,17 *+	38,26±0,12 +*	39,29±0,14 +
	Опыт II Experiment II	-	-	-	36,53±0,14 +*Δ	40,93±0,15 +*Δ
Площадь сечения цитоплазмы, мкм 2 Cytoplasm section area, μm 2	Контроль Control	105,25±0,48	171,33±1,40 +	210,47±1,15 +	225,45±0,93 +	217,48±0,89 +
	Опыт I Experiment I	105,25±0,48	179,40±1,26 *+	186,18±0,92 *+	191,81±0,78 +*	193,88±0,90 *
	Опыт II Experiment II	-	-	-	201,53±0,85 +*Δ	211,37±0,84 +*Δ
Ядерно-цитоплазматическое отношение, % Nuclear-cytoplasmic ratio, %	Контроль Control	22,94±0,11	21,99±0,13 +	19,64±0,11 +	17,38±0,08 +	18,30±0,08 +
	Опыт I Experiment I	22,94±0,11	19,62±0,12 *+	21,52±0,12 *+	20,10±0,08 *+	20,45±0,10 *+
	Опыт II Experiment II	-	-	-	18,47±0,09 +*Δ	19,63±0,08 +*Δ

Примечание. * – статистически значимое отличие по сравнению с контрольным значением (р<0,05); + – статистически значимое отличие по сравнению с предыдущим значением (р<0,05); Δ – статистически значимое отличие по сравнению с значением I опытной группы (р<0,05).

Note. * – the differences are significant compared with the control group (p<0.05); + – the differences are significant compared with the previous group (p<0.05); Δ – the differences are significant compared with experiment group 1 (р<0.05).

Однако последующее (120–240-е сут) увеличение площадей сечения ядра и цитоплазмы гепатоцитов обусловливает снижение ядерно- цитоплазматического отношения гепатоцитов в этот период. При этом значения ЯЦО опытных животных превышают аналогичные зна- чения животных контрольной группы, что связано с меньшим размером цитоплазмы гепатоцитов животных, питающихся диспергированной пищей.

После перевода животных, питающихся от позднего молочного до пубертатного периода постнатального онтогенеза диспергированной пищей, на корм с естественными механическими свойствами наблюдается уменьшение площади сечения ядер гепатоцитов до 36,53±0,14 мкм2 (р<0,05) к пубертатному периоду с последующим возрастанием значения данного параметра до 40,93±0,15 мкм2 к зрелому возрасту, что превышает соответствующий показатель как контрольных, так и опытных животных I группы. Размеры цитоплазмы гепатоцитов животных II опытной группы с позднего пубертатного до зрелого возраста постепенно возрастают, превосходя значения опытных животных I группы и приближаясь к значениям контрольных животных. ЯЦО гепатоцитов животных II опытной группы от пубертатного до репродуктивного периода снижается (18,47±0,09 %), а к зрелому возрасту увеличивается (19,63±0,08 %, р<0,05), оказываясь в период от 180-х по 240-е сут развития меньше значений животных I опытной группы, но больше значений животных контрольной группы (табл. 1).

С 21-х по 60-е сут постнатального онтогенеза наблюдается значительное уменьшение количества гепатоцитов на стандартную площадь среза (10 000 мкм2) как в контрольной, так и в опытной группе. Общее количество гепатоцитов на стандартную площадь среза 21-суточных животных составляет 70,65±0,38 клетки, уменьшаясь к 60-суточному возрасту до 24,71±0,38 клетки у контрольных и до 32,87±0,67 (р<0,05) клетки у опытных животных (рис. 2). Эти изменения связаны с интенсивным ростом гепатоцитов. При этом размеры и количество клеток опытных животных несколько больше соответствующих значений контрольных животных (р<0,05). Данная временная гипертрофия и повышенное количество гепатоцитов опытных животных, вероятно, являются признаком адаптационных процессов в печени, ее реакцией на воздействие измененных физических свойств пищи.

Также в этот возрастной период (с 21-х по 60-е сут) количество двуядерных гепатоцитов изменяется сходным образом, уменьшаясь с 5,95±0,20 клетки у 21-суточных животных до 2,58±0,12 и 2,81±0,12 (р<0,05) у контрольных и опытных 60-суточных животных соответственно (рис. 3, 4).

сутки days

Рис. 2. Возрастная динамика суммарного количества гепатоцитов животных контрольной (контроль) и опытной (опыт I, опыт II) групп

Fig. 2. Age-related dynamics of the total hepatocyte number in the control (control) and experimental (experiment I, experiment II) groups

сутки days

Рис. 3. Возрастная динамика абсолютного количества двуядерных гепатоцитов в печени животных контрольной (контроль) и опытной (опыт I, опыт II) групп

Fig. 3. Age-related dynamics of the total binuclear hepatocyte number in the liver in the control (control) and experimental (experiment I, experiment II) groups

Различия в абсолютном и относительном количестве двуядерных гепатоцитов между контрольными и опытными 60-суточными животными статистически недостоверны, однако увеличение относительного (%) количества двуядерных паренхимных клеток печени у 60-суточных животных обеих эксперимен- тальных групп по сравнению с 21-суточными животными (р<0,05) свидетельствует об усилении пролиферативных процессов, обусловленных, вероятно, естественным физиологическим процессом роста органа в данном возрастном периоде.

сутки days

Рис. 4. Возрастная динамика относительного количества (%) двуядерных гепатоцитов в печени животных контрольной (контроль) и опытной (опыт I, опыт II) групп

Fig. 4. Age-related dynamics of binuclear hepatocyte relative number (%) in the liver in the control (control) and experimental (experiment I and experiment II) groups

В последующий период (60-120-е сут) наблюдается уменьшение количества гепатоцитов на единицу площади в обеих экспериментальных группах, что обусловлено возрастанием площади сечения гепатоцитов. В отличие от контрольных, гепатоциты опытных 120-суточных животных характеризуются менее интенсивным ростом площади сечения, что обусловливает повышенное количество гепатоцитов на стандартную площадь среза, достигающее 23,01±0,32 клетки, из которых 0,61±0,05 (2,80±0,23 %) - двуядерные (рис. 3, 4). В период с 60-х по 120-е сут, по сравнению с показателями контрольных животных, количество двуядерных клеток опытных животных уменьшается несколько более значительно и затем статистически значимо не изменяется в последующие возрастные этапы. Уменьшение количества двуядерных клеток в этот период, вероятно, обусловлено цитотомией двуядерных клеток, что является признаком интенсивных процессов, связанных с пролиферацией, физиологической возрастной гиперплазией и полиплоидизацией [11].

В последующем, в период со 120-х по 180-е сут постнатального онтогенеза, количество гепатоцитов животных экспериментальных групп на стандартную площадь среза начинает несколько увеличиваться. Количество паренхимных клеток печени на единицу площади 180-суточных контрольных животных возрастает до 20,42±0,34 (р<0,05), двуядерных - до 0,40±0,05 (1,47±0,18 %), при этом площадь сечения гепатоцитов животных данной группы продолжает также увеличиваться (260,41±0,93 мкм2, р<0,05). Необходимо отметить, что количество двуядерных клеток в печени контрольных животных к 180-суточному возрасту достигает минимальных значений, что, вероятно, связано с окончанием роста органа, установлением структурной зрелости его ткани и достижением базового уровня функционирования [11, 12]. В отличие от животных контрольной группы, у 180-суточных опытных животных количество двуядерных клеток остается постоянным. Общее количество гепатоцитов у них составляет 26,32±0,37 клетки, что превосходит аналогичные показатели контрольных животных того же возраста и обусловливается меньшими размерами ядер и цитоплазмы.

Со 180-х по 240-е сут у контрольных животных продолжается некоторое увеличение количества гепатоцитов на стандартную площадь, обусловленное снижением их площадей сечения, достигая к 240-суточному возрасту значения 21,70±0,38 клетки, из которых 0,59±0,05 (2,93±0,24 %) гепатоцита являются двуядерными. При этом некоторое увеличение количества двуядерных паренхимных клеток в данный возрастной период, возможно, является признаком процессов полип-лоидизации, что характерно для гепатоцитов в зрелом возрастном периоде [11]. Обратная тенденция наблюдается у 240-суточных опытных животных: общее количество гепатоцитов на стандартной площади среза печени уменьшается (р<0,05) до 25,02±0,39, а общее количество двуядерных гепатоцитов - до 0,57±0,05 клетки (2,11±0,19 %, р>0,05). Уменьшение количества клеток на стандартную площадь среза у опытных животных обусловлено увеличением объема гепатоцитов, что выражается в возрастании их площадей сечения (233,22±0,92 мкм2, р<0,05). Необходимо отметить, что количество двуядерных гепатоцитов у опытных животных меньше аналогичного показателя у контрольных животных того же возраста.

При переводе животных, питающихся от позднего молочного до пубертатного периода постнатального онтогенеза диспергированным кормом, на питание пищей с естественными физическими свойствами наблюдается увеличение количества гепатоцитов на стандартную площадь среза к 180-м сут (25,72±0,42, р>0,05) и последующее возвращение к исходным значениям (23,01±0,36, р>0,05) к 240-м сут постнатального онтогенеза. При этом данные изменения сопровождаются увеличением площади цитоплазмы гепатоцитов. Количество двуядерных гепатоцитов на стандартную площадь среза животных II опытной группы с позднего пубертатного до репродуктивного возраста постепенно снижается (0,40±0,04, р>0,05; 1,45±0,16 %, р>0,05), а затем возрастает к периоду зрелости (0,63±0,05, р>0,05; 2,72±0,22 %, р>0,05), по- вторяя динамику изменений аналогичных показателей контрольных животных.

Общие тенденции постнатального развития гепатоцитов печени белых крыс, содержащихся на естественном для грызунов рационе питания, можно охарактеризовать следующим образом: с позднего молочного по поздний пубертатный период происходит интенсивный рост паренхимы печени. Это подтверждается увеличением размера гепатоцитов, при этом их количество на стандартную площадь уменьшается, а количество двуядерных клеток возрастает, особенно у 60-суточных животных. Увеличение двуядерных клеток указывает на интенсивные процессы пролиферации и дифференцировки. В последующий период, со 120-х по 180-е сут (с позднего молочного по репродуктивный период), размеры клеток достигают максимальных значений, количество гепатоцитов на стандартную площадь уменьшается, что свидетельствует об активных синтетических процессах в цитоплазме гепатоцитов и функциональной активности клеток. Период с репродуктивного до зрелого возраста (180-е – 240-е сут) характеризуется некоторым увеличением размеров ядер и небольшими колебаниями размеров цитоплазмы гепатоцитов, а также увеличением количества двуядерных клеток, это свидетельствует о процессах их полиплоидиза-ции, что характерно для гепатоцитов зрелых животных.

Динамику постнатального развития гепатоцитов животных, получающих диспергированную пищу, можно условно разделить на два этапа. Первый этап выражается в увеличении количества и объема гепатоцитов животных, питающихся измельченной пищей, в период с 21-х по 60-е сут до значений больших, чем у контрольных животных. Это может свидетельствовать об интенсивном росте паренхимы печени, при котором происходит пролиферация и дифференцировка новых гепатоцитов, и активном протекании синтетических процессов в уже существующих клетках на фоне развития и возрастания числа их органоидов и субклеточных структур, что дает возможность клеткам усилить свою метаболическую активность в ответ на воздействие фактора [11–13].

Второй этап связан с периодом постнатального онтогенеза от раннего пубертата до возмужания и характеризуется стойкими ги-потрофическими изменениями гепатоцитов и, как следствие, увеличением их количества на стандартную площадь среза. Физиологическое увеличение размера клеток паренхимы печени в процессе роста организма белых крыс, питающихся диспергированной пищей, снижено по сравнению с контрольными животными. Период с 60-х по 120-е сут характеризуется гиперактивностью, при этом возрастает ядерно-ци-топлазматическое отношение ввиду увеличения функциональной активности и объема ядра в ответ на расходование клеткой пластических веществ в предыдущий возрастной период. Изменения размеров ядер, наступающие в результате функциональных сдвигов, предшествуют изменениям объема цитоплазмы [11, 12, 14]. В период от позднего пубертатного до зрелого возраста (120–240-е сут) размеры ядер гепатоцитов опытных животных изменяются неравномерно, тогда как цитоплазма клеток демонстрирует стойкое снижение площади сечения, при этом количество клеток на стандартную площадь увеличено, а количество двуядерных гепатоцитов снижено. Эти изменения обусловлены постоянным воздействием фактора (длительное питание диспергированной пищей), что не позволяет клетке достичь базового уровня функционирования и соответствующего объема.

После перевода животных, питающихся от позднего молочного до пубертатного периода постнатального онтогенеза диспергированной пищей, на корм с естественными механическими свойствами наблюдается увеличение количества гепатоцитов на стандартную площадь среза, уменьшение площади сечения ядер и снижение количества двуядерных гепатоцитов в период со 120-х по 180-е сут. Это свидетельствует о регенераторных процессах, связанных с цитотомией двуядерных клеток, которая приводит к увеличению их количества [11–15]. В последующем периоде (180–240-е сут) тенденция изменения размеров гепатоцитов, их суммарного количества, а также количества двуядерных клеток животных II опытной группы приближается к соответствующим контрольным значениям, но не достигает их.

Заключение. Изложенное выше позволяет сделать вывод, что длительное потребление экспериментальными животными диспергированной пищи оказывает влияние на постнатальную динамику цитометрических и ги-стометрических показателей печени, приводя к уменьшению размеров гепатоцитов и увеличению их количества на стандартную площадь среза. Возврат к питанию пищей с есте- ственными механическими свойствами со 120-х по 240-е сут постнатального онтогенеза не обеспечивает полного восстановления цитометрических параметров печени, о чем свидетельствуют пониженные значения объемов ядер и цитоплазмы гепатоцитов животных II опытной группы по сравнению с таковыми контрольных животных.