Влияние донора оксида азота на процессы экзо- и эндоцитоза синаптических везикул в двигательном нервном окончании мыши в условиях моделирования сахарного диабета

Сахарный диабет (СД) - хроническое заболевание эндокринной системы человека, характеризующееся длительным повышением концентрации глюкозы в крови и сопутствующими изменениями процесса обмена веществ. Одним из серьезных осложнений при СД являются периферические нейропатии, которые характеризуются мышечной слабостью, уменьшением чувствительности, атрофией мышц [1]. Оксид азота (NO) является участником практически всех метаболических и физиологических процессов, играя роль универсального регулятора. Данные о роли NO в патогенезе сахарного диабета противоречивы. В ряде исследовании обнаружено снижение продукции при диабете [2]. Вместе с тем содержание метаболитов NO в плазме при СД может быть как повышенным, так и сниженным [3].

Целью нашей работы являлось исследование роли NO в регуляции процессов эндоцитоза синаптических везикул в двигательном нервном окончания мыши при экспериментальном СД.

Материал и методы.

Эксперименты проводили на изолированных нервно-мышечных препаратах диафрагмальной мышцы лабораторных белых мышей. Нервно-мышечный препарат выделяли и помещали в ванночку, перфузируемую оксигенированным раствором Кребса.

Для исследования процессов эндоцитоза синаптических везикул в двигательном нервном окончании использовали флуоресцентный маркер FM 1-43 (3 мкМ), который обратимо связывается с пресинаптиче-ской мембраной и во время эндоцитоза синаптических везикул оказывается внутри нервной терминали («загрузка» терминали). Показателем эндоцитоза и загрузки флуоресцентного красителя в синаптические везикулы являлось появление ярко светящихся пятен внутри нервного окончания. Стимуляцию двигательного нерва с частотой 50 Гц производили в течение 1 мин. Использовали следующий протокол «загрузки»: FM 143 присутствовал в растворе в течение 1 мин во время стимуляции и 7 мин после ее окончания.

Регистрацию свечения нервных окончаний проводили с помощью микроскопа AxioScope A1 («Carl Zeiss», Германия), оснащенного быстродействующей черно-белой видеокамерой AxioCam MRm («Carl Zeiss», Германия). Все наблюдения проводили только на поверхностно-лежащих нервных окончаниях. Оценивали среднюю интенсивность свечения на участке нервной терминали длиной 10-20 мкм в относительных единицах (о.е.), оценивая свечение пикселя от 0 до 256.

В опытах использовали донор NO (S-нитрозо-N-ацетил-DL-пеницилламин, SNAP, 100 мкМ) и блокатор синтеза NO (NG-нитро-L-аргинин метилового эфира, LNAME 100 мкМ).

Результаты и обсуждение.

У контрольных животных свечение нервных терминалей составило 87±3 о.е. (n=13). У животных с экспериментальным СД свечение нервных терминалей было достоверно выше – 95±3 о.е. (n=6; n<0,05). Полученные данные указывают на усиление процессов эндоцитоза синаптических везикул в нервных окончаниях мышей с моделью СД.

Известно, что NO снижает освобождение медиатора из нервно-мышечного окончания холоднокровных животных [4] и замедляет процессы рециклирования синаптических везикул у теплокровных [5]. Для исследования действия NO препарат предварительно выдерживали в течение 25 минут в растворе содержащим донор NO – SNAP. Свечение нервных терминалей снижалось как у контрольных животных так и у животных с моделью СД и составило 77±2 и 73±3 о.е. соответственно (р<0,05). Известно, что NO, продуцирующийся в условиях высокочастотной активности, участвует в регуляции высокочастотной депрессии секреции медиатора, замедляя процессы рециклирования и/или мобилизации синаптических везикул у теплокровных [5]. Добавление экзогенного NO приводит к снижению скорости эндоцитоза синаптических везикул в двигательном нервном окончании и в условиях экспериментального CД. Предварительное выдерживание препарата в растворе содержащим блокатор синтеза NO приводило к усилению свечения терминалей до 92±2 о.е. у контрольных животных и не изменяло свечения у животных с моделью СД. Возможно снижение экспрессии фермента NO–синтазы при СД [3] является благоприятным фактором для нормального функционирования синапса в условиях высокочастотной активности.