Влияние доступности фосфата в среде на экспорт глутатиона из клеток Escherichia coli

Регуляция жизнедеятельности бактерий является одним из актуальных направлений современной экспериментальной биологии. В последние десятилетия все большее внимание уделяется исследованию регуляторных механизмов с участием редокс-активных соединений. В этот способ регуляции во-

(С Тюленев А. В., Смирнова Г. В., Октябрьский О. Н., 2015

в лечены активные формы кислорода (АФК), в особенности супероксид и перекись водорода. В другую группу входят эндогенные соединения, способные к редокс-превращениям, среди них особое значение имеют соединения, содержащие тиоловые (SH-) группы, глутатион (GSH)* тиоредоксин* глутаредоксин и др* Взаимодействие АФК, указанных тиолов и SH- групп в белках приводит к изменению активности этих белков, что составляет молекулярную основу редокс-регуляции*

Хорошо известна роль глутатиона как главного цитоплазматического редокс-буфера и антиоксиданта* имеющего большое значение в поддержании S-S/SH-равновесия в белках [Meister* Anderson* 1983; Schafer, Buettner* 2001]* Известно* что у эукариот GSH принимает участие в антиоксидантной защите* регуляции экспрессии генов* клеточной сигнализации, а также вовлечен в механизм программируемой клеточной смерти - апоптоза [Klatt, Lamas* 2000]* Функции GSH у бактерий изучены в меньшей степени. Глутатион содержится в миллимолярных концентрациях в большинстве грамогрицательных и в некоторых грам положительных бактерий [Fahey el al** 1978]* В этих организмах он играет важную роль в защите от многих токсических соединений. Как компонент тиоловых редокс-систем глутатион вместе с глутаредоксина-ми восстанавливает окисленные SH-группы в глобальных регуляторах OxyR и Fur [Aslund et al * 1999], Мутанты E. coli, дефицитные по синтезу глутатиона* проявляют повышенную чувствительность к гиперосмотическому и холодовому стрессам [Смирнова* Октябрьский* 2005]*

Целью настоящей работы является изучение влияния трансмембранных ионных потоков на экспорт глутатиона у бактерий Е, coll.

Материалы и методы исследования

Штаммы бактерий и условия культивирования. В качестве объекта исследований использовали штаммы Е. coll BW25113 ^(агаО-агаВ>5<Я, MacZMWl^ miBA), rphA, ^rhaD-rhaB>5<)^, hsdR5\± JW3460 (4^U749::kan); JW2955 (Ap/7Z?760::kan); JW3 704 ^4757::kan; JW03 89 (A^o5765::kan); JW03 90AphoR764::kan, полуденные из E, coll Genetic Stock Center (CGSC).

Бактерии выращивали в аэробных условиях на синтетической минимальной среде М9 (Na₂HPO₄ ♦12Н_:О - 15.13 г/л; КН₂РО₄ - 3 г/л; NH.C1 - 1 г/л; NaCl - 0.5 г/л; MgSO₄*7H₂O - 0.246 г/л; СаСГ - 0.011 г/л) [Miller, 1972] с добавлением 0.15%-ной глюкозы или на среде MOPS (3-[№Морфолино] Пропансульфоновая кислота -8.37 г/л; Трицин -1.79 г/л; FcSOt7H₂O - 0.0028 г/л; NL^Cl - 0.51 г/л; K₂SO^ -0.048 г/л; СаС1₂ - 0.0014 г/л; MgCb 6Н₂О - 0.107 г/л;

NaCl - 2.92 г/л) [Neidhardt et al., 1974] с 0*15% глюкозы и заданной концентрацией фосфата.

Клетки из ночной культуры центрифугировали и ресуспендировали в 100 мл свежей среды до оптической плотности OD^oo =0*2 и подращивали при 37°С в колбах объемом 250 мл в термостатируемом орбитальном шейкере при 150 об/мин* По достижении OD6№ = 0.5 клетки разбавляли подогретой средой и выращивали в колбах объемом 250 или 50 мл в аналогичных условиях. За ростом следили путем измерения оптической плотности при длине волны 600 нм (OD^X

Удельную скорость роста культуры (ц) рассчитывали по формуле lnC^№(/a-lr^^

где OD_6w(f₂) и OD^ft) - оптическая плотность культуры* измеренная При длине ВОЛНЫ 600 НМ* во время ь и Л*

Колоннсобразующую способность определяли в образцах, отобранных с заданными интервалами времени. После отмывания и приготовления серии разведений в 0.9%-ном растворе NaCl клетки смешивали с расплавленным при 42°С мягким (0.8%) LB-агаром и выливали на чашки Петри, содержащие твердый LB-arap (1.5%). Количество образовавшихся колоний (КОЕ) подсчитывали через 24 ч. инкубации в термостате при 37°С.

Изменения мембранного потенциала исследовали по методу [Wickens ct al., 2000]* Для этого бактериальную культуру (180 мкл) смешивали с 20 мкл раствора DiBAC₄(3) с концентрацией 100 мкг/мл и выдерживали в темноте при 37°C в течение 10 мин. Затем 10 мкл образца наносили на предметное стекло с 1%-ной агарозой и исследовали с помощью флуоресцентного микроскопа Leica DM2000 (фильтр-система 13). Общее количество клеток подсчитывали в проходящем свете. Для каждого образца анализировали нс менее 800 клеток* Эксперименты проводили 3^6 раз в различные дни.

Определение концентрации глутатиона выполняли с помощью модифицированного метода Титца [Tietze, 1969, Smirnova, Muzyka,Oktyabrsky, 2012].

Продукци ю экстраклсточного су пороке ид а определяли по восстановлению цитохрома с методом, предложенным [Korshunov, Imlay; 2006].

Статисти чсс кую обработку экс по р имсн-тальных данных осуществляли с помощью пакета программ Microsoft Excel 1 и Statistica 6.0, вычис- ляя среднее значение, стандартную ошибку и доверительный интервал. Каждый результат показан как среднее значение из трех независимых экспериментов ± стандартная ошибка среднего.

Результаты и их обсуждение

Для изучения связи между транспортом фосфата и статусом глутатиона бактерии Е. coh выращивали на среде MOPS, не содержащей фосфата. При необходимости фосфат добавляли в среду в необходимых количествах. Параллельно часть исследований проводили с использованием среды М9, содержащей 27 мМ фосфата (РО43) Ночную культуру. выращенную при низкой концентрации фосфата (не более 150 мкмоль), центрифугировали и переносили в колбы со средой MOPS без фосфата (Р.) или с 2 мМ КН2РО4- При отсутствии лимитации по Р| клетки родительского штамма BW25113 (wt) росли на среде MOPS с той же скоростью. как на среде М9. В то же время, базовый уровень экстраклеточного глутатиона (GSH^t) на среде MOPS был в 2.5 раза выше, чем на среде М9 и сохранялся постоянным в процессе культивирования, тогда как на среде М9 по мере роста происходило накопление (GSH^) пропорционально приросту биомассы (табл. 1).

Таблица 1

Уровни GSH_out и GSH_in в растущих и голодающих по фосфату культурах Е* coll BW25113

мкМ/ОП^ю	M9 рост	MOPS рост	MOPS голод
GSHout	1.12±0.024	2.08±024	146±0.03
GSHU1	63±0.4	9.4±06	24.8±06

При переносе клеток из ночной культуры в среду MOPS с глюкозой, не содержащую Р^ происходило постепенное исчерпание остаточного фосфата. содержащегося в инокуляте что приводило к постепенному снижению удельной скорости роста (C О.5±О,ОЗ ч'1 до 0.17±0.01 ч-1), длившемуся в течение 180 мин. По сравнению с растущей культурой уровень наружного глутатиона в этих условиях постепенно снижался в 1.4 раза, тогда как концентрация внутриклеточного GSH продолжала возрастать. Отношение уровня внутриклеточного глутатиона (GSH^) к его концентрации в среде (GSHiVGSHout) в голодающей по фосфату культуре достигало 17, тогда как в нелимитированных по фосфату растущих культурах это соотношение было равно 5.6 на М9 и 3.4 на среде MOPS. Эти результаты показывают, что при исчерпании фосфата снижается экспорт глутатиона в среду и увеличивается его внутриклеточный уровень.

При внесении фосфата (150 мкмоль) в виде КН2РО4 в длительно голодающую культуру на б,-подалось возобновление роста бактерий и быстрый выход глутатиона в среду (табл. 2). Максимальный уровень экстраклеточного GSH, превышающий базовый уровень в 11 раз. достигался через 15 мин. после внесения Pi? через 60 мин, количество экстраклеточного GSH возвращалось к базовому значению, характерному для растущей культуры. Выход GSH в среду’ наблюдался и при замене КН2РО4 на другие источники фосфата (глюкозо-6-фосфат. фруктозо-6-фосфат и их изомеры). Возвращение GSH в цитоплазму замедлялось в мутанте J W3412( AggtX дефицитном по синтезу фермента у-глутамилтранспептидазы (GGT), участвующего в нормальных условиях в импорте глутатиона. Это указывает на то, что в данной ситуации GGT также играет важную роль в транспорте глутатиона внутрь клеток. Следует отметить, что удельная скорость роста (р) бактерий родительского штамма полностью восстанавливалась через 30 мин, после добавления фосфата. в то время как у мутантов JW2663(g^4), дефицитных ио синтезу глутатиона, — только к 45-й мин_ что свидетельствует о вкладе глутатиона в адаптацию Е. coh к изменившимся условиям среды.

Таблица 2

Изменения количества GSH_ollt и удельной скорости роста при внесении Р; в голодащую по фосфору культуру Е, coll родительского штамма и gshA мутантов

Время	0 мин (+Pi)	15	30	45	60
GSH^t	0.61±0.077	6.57±0.265	4.35±0.234	2.53±0.214	1 31±0.111
pWT	0.17±0.012	0 35=bG019	0.58±0.015	О.62М).О22	0.62±0.013
pAgshA	0.10±0.015	035±0011	047±0.022	0.60±0013	05й±0.017

Для того чтобы исследовать связь между импортом Р; и экспортом GSH, были использованы мутанты (pitA? pitB, pstA\ лишенные различных транспортеров фосфата, а также мутанты по регуляторам фосфатного оперона pho В и phoR. Низкоаффинные Pit А и Pit В осуществляют транспорт Pi в цитоплазму с высокой скоростью, тогда как комплекс PstSCAB, находящийся под контролем pho -регул она. отвечает за высокоаффинный перенос Р; с низкой скоростью. Активация /э/ю-регулона происходит при снижении концентрации фосфата в среде меньше 4 мкмоль [Wanner 1997: Hsieh,

Wanner, 2010]. Интересно, что это значение близко к минимальной концентрации фосфата в среде (6 мкмоль), которая вызывала стимуляцию экспорта глутатиона в наших условиях.

Отсутствие транспортера PitA увеличивало уровень GSHo,lt в ответ на добавление фосфата на 25% по сравнению с родительским штаммом. Не отмечено существенной разницы по этому показателю между7 остальными мутантами и родительским штаммом* Таким образом, в описываемой ситуации не выявлено тесной связи между уровнем экстраклеточного глутатиона и скоростью входа фосфата в клетки* Выход глутатиона может стимулироваться при входе фосфата по любой из известных для него транспортных систем*

Мы также проверили влияние на экспорт глутатиона транспорта сульфат-аниона (SO?') Для создания дефицита сульфата в среде использовали модифицированную среду М9, в которой MgSOj заменяли на эквимолярное количество MgCL Длительное голодание по источнику серы сопровождалось снижением удельной скорости роста до 0*1 ч"1, при этом уровень наружного GSH прибли жался к нулю (-0*04 мкмоль/OD^oo) При добавлении 0*5 ммоль MgSO4 к голодающим клеткам, наблюдалось быстрое возобновление роста и такой же быстрый выброс GSH в среду* Максимальный уровень GSHoUt. в 20 раз превышающий значение в голодающей культуре, достигался через 45 мин. после добавления сульфата. Через 90 мин. количество наружного глутатиона падало вдвое и далее удерживалось на этом уровне*

Известно, что PitA, кроме фосфата, может транспортировать в клетки арсенат [Rosenberg* Gerdes, Chegwidden, 1977; Rosen* Liu, 2009]. В наших условиях внесение арсената натрия (100 мкмоль) в длительно голодающую по фосфату культуру вызывало необратимый выход глутатиона (табл. 3). Для бактерий, как и для других живых клеток* арсенат токсичен* и его внесение в культуру Е. coli вызывало ингибирование роста, которое, однако, не сопровождалось лизисом клеток* Это свидетельствует о том* что выброс глутатиона при действии арсената не являлся результатом диффузии GSH из погибших клеток*

Таблица 3

Изменение экспорта GSH и ростовых параметров при внесении арсената в голодающую культуру Е» coll (wt)

Время	0 (+А$)	15	30	45	60	75
СЗНощ	0,33^0,04	0,24±0,05	1,01X1,06	1,61X1,13	2,04X1,14	2.64X1,29
И	0,162^0,018	0,165X1,005	-0,039X1,005	-0,056Х,01	-0,027X1.004	0,053X1,006
OD6(W	0,684^0,013	0,714X1,012	0.705X1,011	0,698X1,008	0,693±0,007	0,683±0,007

Примечательно* что активация экспорта глутатиона происходила как при стимуляции роста после добавления фосфата или сульфата* так и при ингибировании роста при обработке культуры арсенатом* Поскольку все три испытанных вещества (фосфат* сульфат и арсенат) транспортируются в виде анионов, их массированный вход в цитоплазму голодающих клеток может вызвать временный электрический дисбаланс. Этот дисбаланс может быть нейтрализован путем симпорта указанных анионов с каким-либо катионом (например, К ) или путем антипорта с другим анионом* Известно* что при физиологических условиях GSH является анионом. Учитывая вышесказанное, можно предположить, что в наших условиях движение аниона (фосфата* сульфата или арсената) в цитоплазму могло быть одним из стимулов к активации экспорта глутатиона* Полученные данные дают дополнительные аргументы в пользу высказанной ранее гипотезы о существования связи между трансмембранными потоками ионов и циркуляцией глутатиона [Smirnova, Muzyka* Oklyabrsky* 2012]*

Добавление Pi к клеткам Е. coir голодающим по фосфату, приводит к появлению субстрата для синтеза АТФ* что должно способствовать стиму- ляции транспорта электронов по дыхательной цепи и изменению электрохимического градиента протонов (ДцН^)* Известно* что у митохондрий возрастание ДцН” выше некоторого предельного значения сопровождается резким усилением продукции супероксида [ Скула чев* 1989]* Используя флуоресцентный краситель DiBAC4(3)* мы проследили за изменениями мембранного потенциала и продукции супероксида у Е. coli при добавлении к голодающей культуре. В наших условиях добавление фосфата в голодающую культуру по фосфату Е. coli BW25113 (wt) вызывало преходящее повышение мембранного потенциала и одновременное увеличение продукции супероксида в 3 раза* На основании полученных данных можно предположить следующую последовательность событий после добавления фос^шта в голодающую культуру* Вход фосфата в цитоплазму —* изменение мембранного потенциала —* повышение уровня супероксида в периплазме —* стимуляция экспорта глутатиона из цитоплазмы в периплазму и среду*

Следует обратить внимание, что все рассмотренные выше эксперименты проводились на средах* содержащих глюкозу в качестве источника углерода и энергии* Стимуляция экспорта GSH при добавлении фосфата в голодающую по нему7 куль-туру отсутствовала в среде, не содержащей глюкозы. Этот эффект наблюдался также при предобработке голодающей по фосфату' культуры протоно- фором карбонилцианид-мета-хлорофенил гидразоном (СССР, 20 мкм), который вызывает деэнерги-заиию цитоплазматической мембраны (табл. 4).

Таблица 4

Влияние протонофора СССР и ингибитора АТФ-азы DCCD на экспорт глутатиона у Е* coll BW25113

Время	0 (+Pi)	15	30	45	60
Контроль	0.61±0.077	6.57±0.265	4.35±0.234	2.53±0*214	1.31±0.111
Без глюкозы	O.55±O.O5	0.63±0.1	0.72±0.15	0.74±0.17	0.5±0.05
+DCCD	1±0.1	13.66±0.628	1L53±O389	Ю.98±0.145	10.42±0.389
+СССР	0.4±0.05	0.4±0.1	0.52±0.08	0.67±0Л5	0.54±0*1

Добавление ингибитора АТФ-синтетазы дициклогексил карбодиимида (DCCD) (0.1 ммоль) к голодающим по фосфату7 клеткам родительского штамма нс приводило к существенному7 изменению уровня экстраклеточного глутатиона Однако после внесения фосфата в эту7 культуру наблюдался быстрый выход GSH. амплитуда которого в 2 раза превышала уровень, достигаемый в необработанных DCCD клетках. Этот высокий уровень сохранялся на протяжении всего эксперимента (табл. 4). Известно, что DCCD блокирует поток протонов через канал Fa АТФ-синтетазы. При работе дыхательной цепи закрытие Fo может приводить к повышению АцН\ т.е. СССР и DCCD действуют на A^iET противоположным образом и это может объяснять различные эффекты двух соединений на экспорт глутатиона Наши результаты указывают на то, что энергизация мембраны и наличие ДцРГ являются необходимым условием экспорта GSH в ответ на добавление фосфата в голодающую по Pi культуру.

Исследования поддержаны грантом Программы МКБ Президиума РАН №12-П-4-1013 и грантом РФФИ№ 13-04-00706.