Влияние фитогормонов и арахидоновой кислоты на продукцию экдистероидов и гликозилфлавонов в Silene amoena (Caryophyllaceae)

В XIX в. Чарльз Дарвин впервые предположил, что определенные химические соединения способны стимулировать рост сельскохозяйственных культур, которые получили название «фитогормоны» [Darwin, 1881]. В настоящее время к фитогормонам относят сигнальные молекулы, вырабатываемые растительными объектами в очень низких концентрациях, контролирующие все аспекты роста и развития растений: эмбриогенез [Shekhawat, Mathur, Batra, 2009; Loyola-Vargas et al., 2019], защита от патогенов [Bari, Jones, 2009; Bürger, Chory, 2019], стрессоустойчивость [Ciura, Kruk, 2018; Ku et al., 2018] и репродуктивное развитие [Sundberg, Østergaard, 2009; Pierre-Jerome, Drapek, Benfey, 2018]. В зависимости от химического строения выделяют несколько различных классов фитогормонов — ауксины, абсцизовая кислота, цитокинины, этилен-гиббереллины, брассиностероиды, жасмонаты и стриго-лактоны [Wani et al., 2016]. Однако сведения о влиянии этих химических соединений на растительный организм остаются отрывочными и зависят от концентрации используемых фитогормонов, их локализации в тканях и органах растений, а также от взаимодействия с другими фитокомпонентами [Davies, 2010]. Располагая информацией о влиянии экзогенных регуляторов на вегетацию и биосинтез метаболитов растительного объекта, можно целенаправленно изменять темпы роста и развития растений, а также накопление биологически активных соединений. Перспективным направлением являются исследования влияния фитогормонов на вторичные метаболиты, такие как экдистероиды и низкомолекулярные фенольные соединения [Villarreal-García et al., 2016].

В ходе продолжающегося химического изучения видов рода Silene [Оленников, Кащенко, Чирикова, 2019; Olennikov, 2019a] в рамках проведенного исследования нами был выбран распространенный в Европейской России, Западной и Восточной Сибири вид данного рода — S. amoena L. [Флора СССР, 1936]. Ранее нами было проведено также исследование химического состава близкого вида S. repens Patrin, изучен экдистероидный и флавоноидный профиль данного растительного вида, произрастающего в Байкальском регионе [Olennikov, 2019b, 2020]. Задачей проведенного исследования было изучение влияния экзогенных фитогормонов на продуктивность и накопление экдистероидов и гликозилфлавонов в надземных и подземных органах S. amoena в условиях интродукции.

Материалы и методы

Растительное сырье . Саженцы Silene amoena были выращены из аутентичных семян, полученных из Главного ботанического сада им. Цицина РАН (Москва, Россия). Семена стерилизовали инкубацией в течение 1 мин в 75 %-ном этаноле, а затем тщательно промывали стерильной водой. Семена проращивали в почве вторфяных горшках в контролируемых условиях при температуре 25/18 °С (день/ ночь), относительной влажности воздуха 70–80 %, освещенности 10 клк и фотопериоде 14 ч. В возрасте 30 дней (2–3 настоящих листа) сеянцы S. amoena высаживали в грунтовую пленочную теплицу (4 раст./м²) на территории приусадебного участка ИОЭБ СО РАН (г. Улан-Удэ, Республика Бурятия) и выращивали в течение 30 дней в весенне-летнем обороте с выполнением всех агротехнических мероприятий. Саженцы S. amoena были разделены на группы по 30 особей. Каждая группа подвергалась опрыскиванию надземной части (24-эпибрассинолид, 4-хлорфеноксиук-сусная кислота, гиббереллиновых кислот натриевые соли, арахидоновая кислота, арахидоновой кислоты этиловый эфир) или прикорневой обработке (индолилмас-ляная кислота) на 1, 7, 14 и 21 сутки в концентрациях 10 и 100 мг/л. Растения обрабатывались методом опрыскивания до стекания первой капли с листа, прикорневая обработка заключалась во внесении 50 мл рабочего раствора в почву. Контрольную группу растений опрыскивали дистиллированной водой. Для обработки использовались разбрызгиватели ручные объемом 1000 мл. Все обработки проходили в раннее время суток, в 9–10 часов утра при температуре воздуха не более 25 °С. Через 30 дней растения извлекали из почвы, корни промывали. Сырье высушивали в конвекционной печи (40 °С) до значений влажности < 5 %, определяли массу листьев и корней. Образцы измельчали, просеивали до среднего диаметра частиц 0,5 мм на просеивающей машине ЭРЛ-М1 («Зернотехника», Москва, Россия).

Общие экспериментальные условия . Масс-спектрометрический анализ проводили на TQ-масс-спектрометре LCMS-8050 (Shimadzu, Columbia, MD, USA). В работе использованы реагенты: эпибрассинолид, индолил-3-масляная кислота, 4-хлорфеноксиуксусная кислота, гибберелиновых кислот натриевые соли, арахидоновая кислота, арахидоновой кислоты этиловый эфир (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA); коммерческие образцы веществ сравнения: 20-гидроксиэкдизон (ООО

Фитопанацея, Москва, Россия), полиподин В, экдизон (ChemFaces, Wuhan, Hubei, PRC). Интегристерон А и 2-дезокси-20-гидроксиэкдизон были выделены ранее из S. jenisseensis [Olennikov, Kashchenko, 2020]. 26-Гидроксиинтегристерон А, 20,26-дигидроксиэкдизон, 26-гидроксиполиподин В, туркестерон, 26-гидроксиэк-дизон, 20-гидроксиэкдизон-2- О -ацетат, витикостерон Е, шафтозид-2′′- О -гликозид (силенезид Е), мелозид А были выделены из S. repens [Olennikov, Kashchenko, 2020], свертизин-2′′- О -гликозид из S. samojedorum [Olennikov, Chirikova, 2019]. Условия пробоподготовки растительных образцов, особенности микроколоночной ВЭЖХ-УФ и ВЭЖХ-ДМД-ИЭР-МС описаны нами ранее [Оленников, Кащенко, 2019; Оленников, Кащенко, Чирикова, 2019]. Статистический анализ проводили с использованием однофакторного дисперсионного анализа (ANOVA). Значимость различий средних определяли с помощью многорангового теста Дункана.

Результаты и обсуждение

Многокомпонентность химического профиля различных видов Silene , собранных в условиях Байкальского региона, была показана нами ранее [Olennikov, 2019b, 2020]. На предварительном этапе исследования для отделения экдистероидов и гликозилфлавонов от посторонних соединений этанольных извлечений из травы и корней интродуцированных образцов S. amoena применяли твердофазную экстракцию на полиамиде, что позволило получить фракции SPE-1 и SPE-2. Данные фракции были исследованы с применением микроколоночной ВЭЖХ-УФ и ВЭЖХ-ДМД-ИЭР-МС. В результате хроматографического анализа фракций SPE-1 из травы и корней интродуцированной S. amoena было выявлено присутствие 12 соединений, отнесенных к группе экдистероидов. Интродуцированные образцы S. amoena по составу экдистероидного профиля не отличались от дикорастущих образцов. Основными экдистероидами интродуцированных образцов травы S. amoena являлись 20-гидроксиэкдизон ( 6 ) и полиподин В ( 7 ), корней — 20-гидроксиэкдизон ( 6 ).

На следующем этапе исследования нами был проведен полевой эксперимент для определения влияния экзогенных фитогормонов на продуктивность и накопление экдистероидных соединений в интродуцированных образцах S. amoena . Было принято решение использовать соединения 6 и 7 в качестве маркерных экдистероидов (табл. 1). Согласно полученным экспериментальным данным обработка саженцев S. amoena брассиностероидом (24-эпибрасинолид) в концентрации 100 мг/л приводила к значительному увеличению средней массы листьев растений (> 1,63 раза). Прирост массы корней при использовании максимальной концентрации 24-эпи-брассинолида увеличился с 50,8 до 60,5 мг. Содержание целевых экдистероидов в листьях S. amoena — 20-гидроксиэкдизона и полиподина B, было максимальным среди всех исследуемых групп растений, обработанных фитогормонами. Возможно, причиной является химическое родство экдистероидов и брассиносте-роидов. В соответствии с ранее полученными сведениями экдистероиды и брасси-ностероиды являются схожими по химической структуре соединениями и могут оказывать опосредованное влияние на количественное содержание друг друга.

Таблица 1

Средняя масса для одного растения и суммарное содержание 20-гидроксиэкдизона ( 6 ) и полиподина В ( 7 ) в органах S. amoena после 1 месяца обработки фитогормонами

Группа	Концентрация, мг/л	Листья			Корни
		масса, мг а	6 , мг/г б	7 , мг/г б	масса, мг а	6 , мг/г б
Контроль (вода)	–	50,3	0,95	0,40	50,8	0,42
24-эпибрассинолид	10	64,3†	2,11†	1,12†	52,1†	0,36†
24-эпибрассинолид	100	81,9†	2,15†	1,12†	60,5†	0,40
Индолилмасляная кислота	10	60,8†	1,00†	0,45	50,3	0,47†
Индолилмасляная кислота	100	64,7†	1,05†	0,49†	57,9†	0,50†
4-Хлорфеноксиуксусная кислота	10	67,7†	1,02	0,34†	56,3†	0,41
4-Хлорфеноксиуксусная кислота	100	78,6†	1,02	0,37	60,4†	0,40
Гиббереллиновых кислот натриевые соли	10	83,5†	0,95	0,41	56,3†	0,50†
Гиббереллиновых кислот натриевые соли	100	115,7†	0,97	0,40	71,9†	0,81†
Арахидоновая кислота	10	60,9†	0,90	0,40	65,8†	0,57†
Арахидоновая кислота	100	81,3†	1,01	0,40	68,3†	0,60†
Арахидоновой кислоты этиловый эфир	10	124,3†	0,84†	0,33†	70,6†	0,71†
Арахидоновой кислоты этиловый эфир	100	145,9†	0,83†	0,29†	71,4†	0,72†

^* Указано среднее значение воздушно-сухой массы для 1 растения ( n = 30). ^б От массы воздушносухого сырья. ^† Разница достоверна по сравнению с данными контрольной группы ( p > 0,95)

Известно, что обработка 4-дневных саженцев Lepidium sativum экзогенным 20-гидроксиэкдизоном приводила к существенному снижению содержания эндогенных брассиностероидов [Tarkowská, Krampolová, Strnad, 2020]. В свою очередь, при обработке саженцев 24-эпибрассинолидом наблюдался противоположный эффект. В соответствии с химическим строением 20-гидроксиэкдизон, полиподин B и 24-эпибрассинолид относятся к классу тетрациклических тритерпенов и включают в себя полигидроксилированные стероидные структуры с оксигенированным

B-кольцом. Однако имеются и структурные различия между этими двумя группами фитостеринов, которые в конечном итоге оказывают прямое влияние на их биологическую активность, а именно: (1) B-кольцо 24-эпибрассинолида содержит только карбонильную группу у C-6, тогда как экдистероиды имеют характерный хромофорный фрагмент 14-гидрокси-7-ен-6-она; (2) ориентация гидроксильных групп у C-2, C-3 и C-22 является зеркальной; (3) сочленение A- и B-колец имеет цис -ориентацию в скелете экдистероидов, в то время как для 24-эпибрассинолида характерна транс -конфигурация [Tarkowská, Krampolová, Strnad, 2020]. Согласно литературным данным, гормональная активность у насекомых или растений регулируется структурой боковой цепи, а не природой стероидного каркаса ядра. В частности, модификации C-20 резко повлияли на гормональную активность как экдистероидов, так и 24-эпибрассинолида [Watanabe, 2015]. Интересно, что полученные данные коррелировали с литературными сведениями только в отношении надземной части S. amoena . Содержание 20-гидроксиэкдизона в корнях по сравнению с контрольной группой существенно не изменилось.

В свою очередь, обработка S. amoena представителем класса ауксинов, индо-лилмасляной кислотой (100 мг/л), оказала наиболее выраженное влияние именно на подземные органы данного растительного вида. Наблюдалось увеличение продуктивности корней с 50,8 до 57,9 мг; содержание 20-гидроксиэкдизона также возрастало с 0,42 до 0,50 мг/г. Фитогормоны ауксины, являясь производными индола, стимулируют рост плодов и побегов растений, рост клеток камбия, вызывают положительный геотропизм корней, влияют на дифференцировку клеток и обеспечивают взаимодействие отдельных органов [Zhao, 2010].

Обработка 4-хлорфеноксиуксусной кислотой (100 мг/л), которая имеет схожее химическое строение c ауксинами, приводила к увеличению продуктивности как надземных (78,6 мг), так и подземных органов (60,4 мг) S. amoena . Содержание 20-гидроксиэкдизона в листьях возрастало до 1,02 мг/г и снижалось в корнях до 0,40 мг/г. Данное соединение используется в сельском хозяйстве для повышения продуктивности видов семейства Пасленовых за счет стимулирования образования завязей и предотвращения их опадания [Sasaki, Yano, Yamasaki, 2005]. Возможно, небольшая длительность эксперимента и отсутствие генеративных органов у саженцев S. amoena не позволили в полной мере оценить влияние данного регулятора роста.

При использовании раствора гиббереллиновых кислот натриевых солей (100 мг/л) наблюдалось повышение продуктивности надземной части S. amoena в 2,30 раза (с 50,3 до 115,7 мг/г). Содержание 20-гидроксиэкдизона при этом повышалось незначительно, а содержание полиподина B не изменялось. Было отмечено увеличение массы корней в 1,42 раза, при этом содержание 20-гидроксиэкдизона в корнях повысилось в 1,93 раза (с 0,42 до 0,81 мг/г). К гиббереллинам относятся фитогормоны с тетрациклической дитерпеновой структурой, функции которых связаны со стимуляцией вегетативного развития растений (прорастание, рост стебля в длину) и генеративного развития (перехода к цветению). Гиббереллины действуют в одном направлении с ауксинами и стимулируют биосинтез и передачу сигнала друг другу [Gupta, Chakrabarty, 2013].

Обработка препаратами арахидоновой кислоты приводила к значительному увеличению продуктивности саженцев S. amoena . Выявлено, что максимальная продуктивность надземных (в 2,90 раза) и подземных органов (в 1,41 раза) из всех экспериментальных групп была отмечена при обработке этиловым эфиром арахидоновой кислоты (100 мг/л). Однако содержание обоих экдистероидов в траве S. amoena было меньше, чем в контрольных образцах. Исследуемые соединения арахидоновой кислоты не относятся к фитогормонам как предыдущие компоненты, а являются элиситорами, т. е. не свойственными для организма растения соединениями, которые попадают в него извне и вызывают устойчивость к фитопатоген-ным инфекциям, что аналогично процессу иммунизации [Dedyukhina, Kamzolova, Vainshtein, 2014]. Ввиду повышенной устойчивости растительных объектов к болезням наблюдается увеличение урожайности.

Исходя из полученных данных можно сделать вывод о том, что применение определенного фитогормона или элиситора в случае S. amoena будет зависеть от задачи исследователя. Если необходимо повысить урожайность S. amoena , то обосновано применение элиситора этилового эфира арахидоновой кислоты. Если же необходимо получить сырье с высоким содержанием экдистероидов, то рекомендовано применение фитогормона 24-эпибрассинолида.

Анализ фракции SPE-2 из травы S. amoena осуществляли методом ВЭЖХ-ДМД-ИЭР-МС, используя для идентификации данные о хроматографической подвижности, УФ и масс-спектрах в сравнении с известными соединениями и сведениями литературы. Всего в SPE-2 было обнаружено 6 компонентов ( 14 – 19 ), отнесенных на основе УФ-спектров к группе гликозилфлавонов, в том числе к производным шафтозида (шафтозид-2′′- О -гликозид, 14 ; шафтозид, 15 ), изовитексина (изовитек-син-2′′- О -гликозид, 16 ; изовитексин, 17 ) и свертизина (свертизин-2′′- О -гликозид, 18 ; свертизин, 19 ). Шафтозид ( 15 ), изовитексин-2′′- О -гликозид (мелозид А, 16 ), изо-витексин ( 17 ) ранее были обнаружены нами в S. repens [18], а свертизин-2′′- О -гли-козид ( 18 ) и свертизин ( 19 ) выявлены в S. amoena впервые. Интерес представляет соединение 14 . УФ-спектр данного соединения характерен для флавонов. Анализ масс-спектра позволяет отнести данное соединение к С -гликозилфлавонам. Молекулярная формула 14 была определена как C₃₂H₃₈O₁₉ ( m/z 725 для [M-H]). Общая картина масс-спектра была близка к таковой шафтозида (апигенин-6- С -глюко-зид-8- С -арабинозид, 15 ), что позволило предварительно охарактеризовать 14 как О -гексозид шафтозида. Ранее соединение 14 ранее было впервые обнаружено нами в S. italica и получило название шафтозид-2′′- О -гликозид (силенезид Е) [Olennikov, Kashchenko, 2020].

На заключительном этапе исследования была проведена оценка влияния экзогенных фитогормонов на содержание гликозилфлавонов 14 – 19 в листьях S. amoena после 1 месяца обработки (табл. 2).

Максимальная концентрация гликозида, шафтозида, силенезида Е (14) наблюдалась при опрыскивании сеянцев S. amoena 24-эпибрассинолидом в концентрации 100 мг/л. Содержание данного компонента увеличивалось в 1,33 раза по сравнению с контролем. В свою очередь максимальная продукция шафтозида (15), доминирующего флавоноидного соединения травы S. amoena, была отмечена при использовании в максимальной концентрации аналога ауксина — 4-хлорфеноксиуксусной кислоты. Содержание шафтозида возрастало с 0,70 до 2,99 мг/г, то есть в 4,27 раза. Для мелозида А (16), который является гликозидом изовитексина, и его агликона изовитексина (17) также было отмечено максимальное накопление при обработке 4-хлорфеноксиуксусной кислотой (100 мг/л). По сравнению с контрольной группой их содержание возрастало в 5 и 2,71 раза соответственно. Максимальное увеличение содержания свертизин-2′′-О-гликозида (18) было выявлено при обработке натриевыми солями гиббереллиновых кислот (100 мг/л) с 0,10 до 0,60 мг/г. Наибольшее накопление агликона свертизина (19) было отмечено в случае обработки арахидоновой кислотой (100 мг/л). Суммарное содержание гликозилфлавонов наблюдалось при обработке сеянцев 4-хлорфеноксиуксусной кислотой в максимальной концентрации и составляло 4,16 мг/г против 1,52 мг/г в контрольной группе.

Содержание гликозилфлавонов в листьях S. amoena после 1 месяца обработки фитогормонами

Таблица 2

Группа	Конц., мг/л	Содержание гликозилфлавонов, мг/г ± S.D.а, б
		14	15	16	17	18	19	Σ 14–19
Контроль (вода)	-	0,58	0,70	0,01	0,07	0,10	0,06	1,52
24-эпибрассинолид	10	0,75†	1,12†	–	0,01†	0,08	0,04	2,00†
24-эпибрассинолид	100	0,77†	1,29†	–	0,01†	0,06†	0,02†	2,15†
Индолилмасляная кислота	10	0,57	1,14†	0,02†	0,10	0,10	0,08†	2,01†
Индолилмасляная кислота	100	0,60	1,17†	0,02†	0,14†	0,14†	0,16†	2,23†
4-хлорфенокси-уксусная кислота	10	0,71†	2,05†	0,01	0,10	0,05†	0,07	2,99†
4-хлорфенокси-уксусная кислота	100	0,76†	2,99†	0,05†	0,19†	0,05†	0,12†	4,16†
Гиббереллиновых кислот натриевые соли	10	0,30†	0,37†	–	0,05	0,53†	0,04†	1,29†
Гиббереллиновых кислот натриевые соли	100	0,35†	0,24†	–	0,07	0,60†	0,03†	1,29†
Арахидоновая кислота	10	0,67†	1,12†	–	0,09	0,15†	0,10†	2,13†
Арахидоновая кислота	100	0,70†	1,45†	0,01	0,14†	0,17†	0,19†	2,66†
Арахидоновой кислоты этиловый эфир	10	0,35†	0,85†	0,02†	0,10	0,05†	0,02†	1,39†
Арахидоновой кислоты этиловый эфир	100	0,34†	0,90†	0,03†	0,15†	0,07†	0,01†	1,50

^* От массы воздушно-сухого сырья. ^б Гликозилфлавоны: 14 — шафтозид-2′′- О -гликозид (силенезид Е), 15 — шафтозид, 16 — изовитексин-2′′- О -гликозид (мелозид А), 17 — изовитексин, 18 — свер-тизин-2′′- О -гликозид, 19 — свертизин. ^† Разница достоверна по сравнению с данными контрольной группы ( p >  0,95).

Таким образом, для получения сырья S. amoena с высоким содержанием гли-козилфлавонов обоснована обработка сеянцев 4-хлорфеноксиуксусной кислотой. Известные сведения литературы о влиянии фитогормонов на продукцию фенольных соединений в растительном организме указывают на то, что брассинолиды и ауксины могут способствовать накоплению флавоноидов [Petridis, 2016].

Выводы

• 1.    В интродуцированных образцах травы и корней Silene amoena выявлено присутствие 12 экдистероидов: 26-гидроксиинтегристерона А, 20, 26-дигидро-ксиэкдизона, 26-гидроксиполиподина В, интегристерона А, туркестерона, 20-гидроксиэкдизона, полиподина В, 26-гидроксиэкдизона, экдизона, 2-дезокси-20-гидроксиэкдизона, 20-гидроксиэкдизона-2- О -ацетата, витикостерона Е.

• 2.    В интродуцированных образцах травы S. amoena выявлено присутствие 6 гликозилфлавонов: производных шафтозида, изовитексина, свертизина. Сверти-зин-2′′- О -гликозид, свертизин и силенезид Е обнаружены в S. repens впервые.

• 3.    Установлено, что для повышения продуктивности S. amoena обосновано применение этилового эфира арахидоновой кислоты. Для получения сырья с высоким содержанием экдистероидов и гликозилфлавонов рекомендовано применение 24-эпибрассинолида (100 мг/л) и 4-хлорфеноксиуксусной кислоты (100 мг/л) соответственно.