Влияние физической нагрузки различной степени интенсивности на гипертрофию кардиомиоцитов и на полиплоидию миокарда крыс

Malyshev I.I., Alpidovskaya O.V., Romanova L.P. The effect of physical activity of varying intensity on cardiomyocyte hypertrophy and myocardial polyploidy in rats. The Siberian Journal of Clinical and Experimental Medicine. 2024;39(1):178–183.

Регулярные физические нагрузки позволяют не только улучшить общее состояние организма, но и являются средством профилактики некоторых заболеваний. Постоянная и адекватная физическая активность улучшает когнитивные функции, снижает риск преждевременной смерти от сердечно-сосудистых заболеваний, инсульта, диабета второго типа и, соответственно, улучшает качество жизни [1]. В среднем взрослый человек должен уделять физическим нагрузкам не менее 150 мин в неделю, 2 дня и более отводить на укрепление мышечной системы [1]. Профессиональные спортсмены зачастую дово- дят интенсивность тренировок до предела с целью улучшения своих показателей. Несоблюдение баланса между нагрузкой и реабилитацией приводит к дезадаптации, что увеличивает риск возникновения различных болезней [2, 3]. Гипертрофия кардиомиоцитов и возможность различных проявлений ее репродукции является важным вопросом в кардиологической клинике. Наступление декомпенсации при заболеваниях сердца с признаками гипертрофии объясняются тем, что функционирующие в усиленном режиме кардиомиоциты не могут устойчиво обеспечить необходимое превышение уровня биосинтеза по сравнению с нормой.

Цель исследования: изучение морфологических показателей кардиомиоцитов левого желудочка сердца и пролиферативной активности кардиомиоцитов крыс при физической нагрузке разной интенсивности.

Материал и методы

В качестве опытных животных были взяты белые нелинейные половозрелые беспородные самцы крыс ( n = 30), имеющие вес 250–265 г. Животные были разделены на три серии. Первой серии крыс давали легкую физическую нагрузку – животных помещали в ванну с температурой воды 32 °С. Животные плавали в ванне 15 мин. Животные второй серии находились в ванне в течение 30 мин. Эту физическую нагрузку на животных мы расценивали как нагрузку средней тяжести. Животные первой и второй серий после извлечения из ванны были активными, подвижными, признаков усталости у них не отмечалось. Для воспроизведения тяжелой физической нагрузки (третья серия) животные плавали в ванной до тех пор, пока они не начинали терять силы и тонуть. Обычно это наступало через 55–59 мин после нахождения животных в воде. После извлечения из ванны животные этой группы были вялыми, некоторое время лежали. Животными всех групп было выполнено 10 сеансов водной нагрузки, после чего их сразу выводили их эксперимента (по 5 животных на серию) с применением золетилового наркоза из расчета 5 мг на 100 г в соответствии с Международными правилами проведения работ с экспериментальными животными. Часть крыс (по 5 животных на серию) забивали через 30 сут после окончания эксперимента. Контролем служили 30 животных аналогичного возраста (по 5 для каждой серии) без физической нагрузки.

Уход за животными осуществляли согласно правилам и нормам обращения с лабораторными животными («Санитарные правила по устройству, оборудованию и содержанию экспериментально-биологических клиник (вивариев)» от 06.04.1973 г.; International Guiding Principles, 2012). Исследование одобрено этическим комитетом Марийского государственного университета (протокол № 1 от 28.04.2023 г.).

После извлечения сердца фиксировали в 10% нейтральном формалине и заключали в парафин; полученные срезы окрашивали гематоксилином и эозином. Количество ДНК в ядрах кардиомиоцитов определяли в микроскопе Биолам-70 с помощью фотометрирования с использованием микрофотонасадки ФМЭЛ-1 и фотометра ФЭУ-79А в проходящем свете с запирающим светофильтром с максимумом светопропускания на длине волны 570 нм с подаваемым напряжением 900 В. Для изучения пролиферативных процессов подсчитывали двуядерные кардиомиоциты на 7 000 ядер (× 900). Для оценки степени гипертрофии измеряли диаметр кардиомиоцитов.

Иммуногистохимическое исследование проводили с использованием маркера Ki-67 (Santa Cruze). Срезы толщиной 3 мкм наносили на высокоадгезивные стекла, обработанные L-polisine, и высушивали при комнатной температуре 24 ч. Окраску проводили ручным и аппаратным способами с использованием иммуногистохимических контейнеров AUTOSTAINER-360 (THERMO, Великобритания) и Leica BOND-MAX (Германия) с привлечением систем визуализации En-vision (DACO, Дания) и NovoLinc polimer (NovoCastra, Великобритания). Контролем служили неиммунизированные сыворотки кроликов и мышей, а также срезы контрольных тканей сердца крыс. Подсчитывали 200 ядер кардиомиоцитов в 6 полях зрения.

Подсчет клеток осуществляли с применением программы SigmaScan Pro5 (США) и микроскопа Carl Zeiss Axio Scope A1 (Германия), × 400. Статистический анализ проводили в программе STATISTICA 10.0 [4]. Нормальность распределения данных определяли с использованием теста Колмогорова – Смирнова и Лиллиефорса. Для анализа различий между выборками использовали t -критерий Стьюдента или U -критерия Манна – Уитни. Статистически значимыми считали различия при p < 0,05.

Результаты

В первых двух сериях миокард животных при макроскопическом исследовании практически не отличался от миокарда контрольных животных. У животных третьей серии была выявлена дряблость сердца, расширение его полостей.

При гистологическом исследовании изменения выявлялись только в миокарде левого желудочка (ЛЖ) крыс третьей серии. Обращали на себя внимание резко выраженные дистрофические (по типу белковой и жировой) изменения кардиомиоцитов. Встречались клетки с некробиозом, с нечеткими границами, с бледно окрашенными ядрами, определялась гомогенная, без четкой исчерчен-ности цитоплазма. В миокарде ЛЖ также имели место немногочисленные очаговые некрозы групп кардиомиоцитов без клеточной реакции. В строме сердца выявлялась резкая отечность, сосуды определялись полнокровными. Описанные признаки в комплексе свидетельствовали о напряженной работе миокарда.

У крыс всех трех серий в гистологических препаратах миокарда ЛЖ имела место гипертрофия кардиомиоцитов: от незначительной (первая серия) до резко выраженной (третья серия). У животных всех групп определялись, наряду с двуядерными кардиомиоцитами, диплоидные и тетраплоидные клетки. Наибольший уровень полиплоидии кардиомиоцитов имел место во второй и третьей сериях (соотношение диплоидных и тетраплоидных кардиомиоцитов в контроле соответствовало 91,6 ± 7,4%; 8,2 ± 6,3%). Результаты исследования приведены в таблице 1.

В таблице 2 представлены морфологические показатели кардиомиоцитов в зависимости от интенсивности физической нагрузки через 30 сут после окончания эксперимента. Как следует из таблицы 2, в первой серии через 30 сут морфологические показатели практически не отличаются от наблюдаемых сразу после окончания опыта: диаметр ядер практически не изменился. Количество двуядерных кардиомиоцитов близко к контрольным цифрам. Число тетраплоидных ядер стало несколько выше, чем сразу после окончания эксперимента.

Во второй серии на фоне умеренной гипертрофии ядер кардиомиоцитов имело место увеличение и числа тетраплоидных клеток, и двуядерных кардиомиоцитов.

В третьей серии в условиях повышенной физической нагрузки на сердце на фоне гипертрофии ядер кардиомиоцитов и их ядер происходило повышение числа тетраплоидных клеток, но одновременно значительно (по сравнению с контролем и с первыми сериями опыта) уменьшалось число двуядерных кардиомиоцитов. Во всех сериях Кi-67 – положительные ядра не выявлены.

Таблица 1. Морфологические показатели кардиомиоцитов левого желудочка сердца крыс после физической нагрузки различной интенсивности по сериям сразу после окончания опыта

Table 1. Morphological parameters of cardiomyocytes of the left ventricle of the heart of rats after physical activity of varying intensity in series immediately after the end of the experiment

Серия Series	Диаметр ядер кардиомиоцитов, мкм Diameter of nuclei of cardiomyocytes, µm	Число двуядерных кардиомиоцитов, ‰ Number of 2-core cardiomyocytes, ‰	Диплоидные / тетраплоидные ядра кардиомиоцитов, % Diploid/tetraploid nuclei of cardiomyocytes, %	Ki-67 Позитивные ядра, % Ki-67 positive kernels, %
Контроль Control	5,2 ± 0,8	12,7 ± 1,9	91,6 ± 7,4 / 8,2 ± 6,3	0
Первая First	5,4 ± 0,9	13,6 ± 4,6*	88,1 ± 4,7 / 11,6 ± 2,8* p < 0,05	0
Вторая Second	5,7 ± 0,8**	28,1 ± 5,2**	81,7 ± 5,3 / 18,3 ± 4,5** p < 0,05	0
Третья Third	7,2 ± 1,7***	7,2 ± 3,7***	70,9 ± 8,0 / 28,1 ± 7,3*** p < 0,05	0

Примечание: * р < 0,000001. * – cравнение с контрольной серией, ** – сравнение с первой серией, *** – сравнение со второй серией.

Note: * р < 0,000001. * – comparison with control series, ** – comparison with series 1, *** – comparison with series 2.

Таблица 2. Морфологические показатели кардиомиоцитов левого желудочка сердца крыс после физической нагрузки различной интенсивности по сериям в опыте через 30 суток после окончания опыта

Table 2. Morphological parameters of cardiomyocytes of the left ventricle of the heart of rats after physical activity of varying intensity in series in the experiment 30 days after the end of the experiment

Серия Series	Диаметр ядер кардиомиоцитов, мкм Diameter of nuclei of cardiomyocytes, µm	Число двуядерных кардиомиоцитов, ‰ Number of 2-core cardiomyocytes, ‰	Диплоидные / тетраплоидные ядра кардиомиоцитов, % Diploid / tetraploid nuclei of cardiomyocytes, %	Ki-67 позитивные ядра, % Ki-67 positive kernels, %
Первая First	5,2 ± 0,8*	14,2 ± 3,4*	85,3 ± 5,3 / 14,7 ± 4,3 p < 0,05	0
Вторая Second	5,3 ± 1,6**	23,3 ± 3,6**	80,8 ± 6,2 / 19,1 ± 5,1** p < 0,05	0
Третья Third	6,2 ± 1,7***	8,1 ± 5,3***	73,4 ± 7,3 / 27,2 ± 6,1*** p < 0,05	0

Примечание: * р < 0,000001. * – cравнение с первой серией, сразу после физической нагрузки, ** – сравнение со второй серией сразу после физической нагрузки, *** – сравнение с третьей серией сразу после физической нагрузки.

Note: * р < 0,000001. * – сompared to Series 1, immediately after exercise, ** – сompared to Series 2, immediately after exercise, *** – сompared to Series 3, immediately after exercise.

Обсуждение

Согласно данным, приведенным в таблице 1, морфологические показатели кардиомиоцитов в первой серии и контроле практически были одинаковыми. Кардиометри-ческое исследование установило преобладание в сердце на всем протяжении эксперимента диплоидных клеток (до 88,1% ± 4,7 на 10-е сут эксперимента), тетраплоид-ных клеток было соответственно 11,7% ± 2,8; октаплоид-ные и 16-плоидные ядра отсутствовали. Диаметр ядер и число двуядерных кардиомиоцитов соответствовали контрольным цифрам.

Морфологические показатели второй серии свидетельствовали о том, что на фоне умеренной физической нагрузки происходила умеренная гипертрофия миокарда с увеличением диаметра ядер кардиомиоцитов, повышением числа тетраплоидных клеток; при этом фиксировались и ядра большей плоидности (в работе указывается соотношение на 10-е сут после начала эксперимента). Более чем в два раза происходило увеличение в миокарде двуядерных кардиомиоцитов.

В третьей серии на фоне выраженной гипертрофии ядер кардиомиоцитов, имело место увеличение числа те-траплоидных клеток, а также клеток большей плоидности.

Казалось бы, что увеличение генома (числа тетрапло-идных кардиомиоцитов) в третьей серии должно было способствовать увеличению двуядерных кардиомиоцитов, однако фактическое уменьшение их числа показы- вает, что произошла депрессия пролиферативных процессов. Ответ на причину такого несоответствия дает, на наш взгляд, гистологическая картина, которая свидетельствует о напряженности миокарда, что приводило к отрицательному изменению механизмов полиплоидии в миокарде опытных крыс.

Явление полиплоидии широко распространено в живой природе среди животных, растений и грибов и наблюдается даже в условиях нормального развития органа. Полиплоидия достигается или делением ядер без деления цитоплазмы или увеличением генома в ядре. Сравнение диплоидных и полиплоидных гепатоцитов в масштабе генома показывает, что полиплоидия индуцирует гены, направленные против патогенов, повреждений ДНК и окислительного стресса [5]. С биологической точки зрения полиплоидия является своеобразным эквивалентом клеточного размножения. Полиплоидия приводит к увеличению размеров клетки, увеличению размеров их ядер, появлению двуядерных клеток [6, 7].

Полиплоидия – характерная черта сердца млекопитающих [6, 9]. Увеличение функциональной нагрузки на орган сопровождается повышением плоидности [8–12]. Показано, что полиплоидная клетка более активна по сравнению с диплоидной клеткой [2, 6]. Таким образом, полиплоидизация, как и гипертрофия клеток, – реакция органа на повышение функциональной нагрузки на орган.

Происхождение двуядерных кардиомиоцитов до настоящего времени не выяснено. При отсутствии митозов кардиомиоцитов в постнатальном онтогенезе наиболее логичным объяснением образования таких клеток является деление клеток амитозом; косвенным подтверждением этому являются картины «целующихся» ядер в кардиомиоците без цитотомии, когда два ядра располагаются в непосредственной близости друг от друга; в результате этого кардиомиоцит остается тетраплоидным. То есть образование двуядерных клеток тесно связано с полиплоидией органа. В первых двух сериях полиплоидия миокарда крыс происходила двумя путями: накоплением ядерного материала в одноядерных кардиомиоцитах и образованием двуядерных клеток. Чрезмерная физическая нагрузка подавляет экспрессию генов провоспалительного цитокина il6, противовоспалительного il10, генов факторов роста, регулирующих пролиферацию – hgf (фактора роста), fgf2 (фактора роста фибробластов), что необходимо для стимуляции пролиферации. В условиях перенапряжения органа, что имеет место в третьей серии, на фоне гибели кардиомиоцитов полиплоидия осуществляется преимущественно благодаря гипертрофии ядер кардиомиоцитов за счет снижения числа двуядерных клеток.

В работе проведено иммуногистохимическое исследование. Во всех сериях Кi-67-положительные ядра не выявлены, что частично согласуется с литературными данными [7], в которых также констатируется отсутствие маркера пролиферации. Однако, видя картины рядом располагающихся ядер кардиомиоцитов, невозможно представить, каким образом возникают такие конструкции, как только не делением ядер кардиомиоцитов. На самом деле ряд авторов наблюдали Ki-67-положительно окрашенные ядра кардиомиоцитов в сердце при инфарктах миокарда [7].

Заключение

Выполненное исследование указывает на то, что наиболее благоприятное воздействие на морфологические показатели кардиомиоцитов ЛЖ сердца (в том числе и на пролиферативную активность кардиомиоцитов) у крыс оказывает физическая нагрузка средней степени интенсивности. Тяжелая физическая нагрузка приводит к стойкой гипертрофии ядер кардиомиоцитов и сопровождается снижением пролиферативной активности кардиомиоцитов. В работе показано, что даже через 30 сут после окончания опыта в миокарде ЛЖ крыс, подвергшихся тяжелой физической нагрузке, морфологические показатели кардиомиоцитов не восстанавливаются до контрольных цифр. Между тем показатели миокарда первой и второй серий через 30 сут полностью возвращаются к исходным значениям. При этом в миокарде крыс второй серии остается увеличенным по сравнению с контролем число двуядерных кардиомиоцитов.

Таким образом, в эксперименте установлено, что умеренная физическая нагрузка наиболее благоприятно воздействует на миокард крыс. Тяжелая физическая нагрузка оказывает стойкое неблагоприятное воздействие на структуру кардиомиоцитов ЛЖ сердца.