Влияние флавоноидов черной смородины на апоптоз эритроцитов голубя

Проведено исследование по изучению механизма действия флавоноидов, выделенных из черной смородины, на эритроциты крови голубя в присутствии пероксида водорода. Показано, что пероксид водорода индуцирует выброс ядра из эритроцитов крови голубя и образование апоптозных везикул, количество которых с увеличением времени и температуры инкубации повышается. Добавление флавоноидов уменьшает количество безъядерных эритроцитов и апоптозных везикул. Также мы исследовали количественное изменение продуктов ПОЛ эритроцитов голубя в норме, при действии индуктора пероксида водорода и ингибитора ПОЛ флавоноидов.

Флавоноиды являются одной из самых распространенных групп фенольных соединений, в основе структуры которых лежит дифенилпропан (рис. 1) или 2-фенилхроман (флаван) [5].

В растениях обнаружено свыше 5 000 флавоноидов с идентифицированной химической структурой [31- Они подразделяются, в соответствии с положением заместителей в молекулах, на флаванолы, антоцианидины, флавоны, флаваноны и халконы.

Флавоноиды являются экзогенными низкомолекулярными антиоксидантами, обладающими свойствами предупреждения возникновения и нейтрализации действия активных молекул кислорода [11], Известно, что токсическое действие активных молекул кислорода проявляется при состояниях окислительного стресса, который сопровождается резкой интенсификацией свободнорадикальных процессов. Многие продукты радикалза-висимых окислительных реакций могут индуцировать апоптоз и некроз [12; 15].

Рисунок 1

Структурная формула флавоноидов

Апоптоз может вызываться при повреждении клетки нерегулируемым перекисным окислением липидов. В норме окислительные процессы в клетке протекают по свободнорадикальному механизму с низкой скоростью. В случаях нарушений защитных функций возникает необходимость восстановления антиоксидантного статуса организма [7; 8].

Одним из возможных путей решения данной проблемы может быть поиск эффективных антиоксидантов. К этому типу веществ относят природные соединения — флавоноиды, способные ингибировать перекисное окисление липидов (ПОЛ) [4]. Продукты ПОЛ разделяются на продукты первичной и вторичной природы. Первичные продукты (диеновые конъюгаты (ДК)) образуются на стадии продолжения цепи. На второй стадии окисления ДК распадаются до альдегидов и кетонов. Одним из продуктов является малоновый диальдегид (МДА). Его реакцию взаимодействия с тиабарбитуровой кислотой мы использовали для оценки интенсивности ПОЛ [1].

Высокая биологическая активность флавоноидов обусловлена их способностью образовывать хелатные комплексы с металлами, а также — выступать в качестве скавендже-ров свободных радикалов [13; 14]. Легкость окисления определяет высокую реакционную (биологическую) активность флавоноидов, которые защищают от окисления другие соединения или способствуют их восстановлению [8; 11; 15], В этом состоят целебные свой- ■ ства флавоноидов, которые наряду с антиок- сидантным действием, обладают антиинфек-ционными, противоаллергическими, антици-тотоксическими, мембраностабилизирующи-ми и другими свойствами [13]. Однако данных о роли флавоноидов вовлеченных в процессы апоптоза недостаточно [2].

Целью работы было изучение морфологических и биохимических изменений в эритроцитах голубя в присутствии пероксида водорода и флавоноидов. Флавоноиды выделяли по методу [10] из ягод черной смородины. В результате фитохимических исследований ягод, был изучен состав физиологически активных веществ, состоящий из кумаринов, флавонолов, флавонов и антоцианов. Кумарины, мешающие количественному определению флавоноидов, отделяли с помощью хло- роформа. Изменения морфологии эритроцитов зависели от времени инкубации и температуры. При действии пероксида водорода образование апоптозных везикул и безъядерных эритроцитов с увеличением времени (6; 12; 24 ч) повышается. В пробе при 24-часовой инкубации безъядерных эритроцитов обнаружено не было: вероятно, они все распадались до везикул. При добавлении флавоноидов с концентрацией 0,025 мкл на 1 мл крови количество апоптозных телец уменьшается (рис. 2).

Вероятно, это связано с уменьшением количества АФК в связи с действием флавоноидов и тем самым с уменьшением количества клеток, подверженных апоптозу [6].

0,8

0,6

0,4

0,2

■без инкубации Об я инкубации □ 12 ч инкубации И24 ч инкубации

Рисунок 2

Образование апоптозных телец: 1 — контроль, 2 — добавление пероксида водорода, 3 — добавление флавоноидов

Инкубация эритроцитов с пероксидом водорода сопровождалась уменьшением количества продуктов ПОЛ, что подтверждает антиоксидантные свойства флавоноидов, способных перехватывать свободные радикалы и образовывать неактивные молекулярные продукты. Характер и направление измене ний зависели как от температуры, так и от длительности времени инкубации. При удлинении времени инкубации содержание продуктов неполного перекисного окисления превышало уровень контроля в два и более раза и снижалось почти до уровня контроля с добавлением антиоксидантов (рис. 3.).

■ без инкубации П6 ч инкубации □ 12 ч инкубации ■ 24 ч нкубации

Рисунок 3

Содержание диеновых коньюгатов и МДА эритроцитов голубя: ^ — контроль, 2 -— добавление пероксида водорода, 3 — добавление флавоноидов. 1* 2, 3, — значения для ДК, 4 — контроль, 5 — добавление пероксида водорода, 6 — добавление флавоноидов. 4, 5, 6 — значения для МДА

Полученные данные подтверждают, что пероксид водорода вызывает биохимические и морфологические изменения в эритроцитах голубя. При внесении флавоноидов эти процессы резко замедляются. Таким образом, пе роксид водорода индуцирует выброс ядра и увеличивает образование продуктов ПОЛ, При использовании ингибитора апоптоза флавоноидов содержание продуктов ПОЛ снижается.