Влияние фосфорорганических инсектицидов на функцию Th1- и Th2-лимфоцитов и продукцию ими цитокинов

В современных условиях особую актуальность представляет изучение действия веществ антропогенного происхождения на живые организмы, системы жизнеобеспечения и различные их ответные реакции, в частности, иммунные. Эта проблема является одной из центральных в общей и экспериментальной экологии. Особый интерес представляют фосфорорганические инсектициды (ФОИ), которые, согласно оценке Всемирной организации здравоохранения (2002 г.), относятся к наиболее опасным ксенобиотикам окружающей среды. Так, за последние 20 лет в 60 странах мира зарегистрировано 34 000 отравлений фосфорорганическими соединениями, при этом более 20% случаев было связано с их использованием в качестве инсектицидов в сельском хозяйстве [1, 2], загрязнением данными токсикантами воды, воздуха и почвы [1, 3]

Широкое распространение ФОИ может оказывать неблагоприятное воздействие на человека, животных, вызывать острые и хронические интоксикации. Это предполагает изучение механизмов формирования постинтоксикационного иммунодефицитного состояния с целью профилактики, возникающих в условиях экологического неблагополучия, различных инфекционных осложнений и заболеваний [3]. Не исключено возникновение аварийных ситуаций на промышленных предприятиях и химических объектах, сопровождающихся выбросом в окружающую среду ФОИ, а также антихолинэстеразных токсичных химикатов (фосфорорганических отравляющих веществ – ФОВ) и поражением людей [4]. В настоящее время за рубежом активно ведутся разработки профилактических и лечебных средств при поражении ФОВ [57], анализируются их отдаленные эффекты [8]. В связи с этим представляется очень важным изучение иммунотрофных эффектов при поражении системы иммунитета человека и животных различными ФОИ, особенно воздействие их на функции Th1- и Th2-лимфо-цитов [1, 3].

Можно предположить, что в реализации иммунотоксических эффектов при отравлениях ФОИ существенное значение имеет поражение ими Th1- и Th2-лимфоцитов [1].

Целью исследования являлась оценка роли Тh1-, Th2-лимфоцитов и продуцируемых ими цитокинов (ИФН- γ , ИЛ-4) в формирование супрессии гуморальных и клеточных иммунных реакций при подостром отравлении ФОИ.

Материал и методы исследования

Эксперименты проводились на беспородных крысах обоего пола массой 180-240 г. Отравление вызывали ФОИ диметилдихлорвинилфосфатом (ДДВФ), карбофосом и метафо-сом, которые вводили животным ежедневно подкожно в дозе 1/7 DL50подкожно в течение 6 сут. (DL50 ДДВФ, карбофоса и метафоса при введении составляли, соответственно, 64,5±2,3; 815,4±28,0 и 25,3±2,6 мг/кг). Показатели системы иммунитета оценивали общепринятыми методами в экспериментальной иммунотоксикологии [1]. Гуморальную иммунную реакцию к тимусзависимому антигену (эритроцитам барана – ЭБ) определяли на 5 сут. по числу антителообразующих клеток (АОК) в селезенке после первого введения ФОИ с одновременной внутрибрюшинной иммунизацией крыс данными антигенами в дозах 2·108 клеток. В использованном тесте гуморальная иммунная реакция на введение ЭБ характеризует способность Th1-лимфоцитов участвовать в продукции В-лим-фоцитами (плазматическими клетками) IgM [9]. При этом животные получали суммарную дозу токсиканта, составляющую 4/7 DL50.. Кроме того, АОК к ЭБ, синтезирующие IgG, определяли в селезенке методом непрямого локального гемолиза в геле на 8 сут. [9, 10]. При этом животные получали суммарную дозу ФОИ, составляющую 6/7 DL50. Данные литературы позволяют считать, что этот метод характеризует преимущественно функцию Th2-лимфоцитов, обеспечивающих синтез IgG1, составляющих около 70% общего числа молекул данного этого класса [9]. Следует отметить, что Th1-лимфоциты обеспечивают возможность образования в этот период ан-тителогенеза, кроме IgM и IgG2а, составляющих не более 20% от всех подклассов IgG [9, 11].

Активность естественных клеток-киллеров (ЕКК) определяли по показателю естественной цитотоксичности (ЕЦ) через 4 сут. после первого введения ФОИ спектрофотометрически. Формирование гиперчувствительно- сти замедленного типа (ГЗТ), характеризующую функцию Th1-лимфоцитов [9], определяли у животных по приросту массы стопы задней лапы (в %). При этом крыс внутрибрюшинно иммунизировали 108 ЭБ через 30 мин. после введения ФОИ. Разрешающую дозу ЭБ (5·108) вводили под апоневроз стопы задней лапы через 4 сут. Реакцию ГЗТ оценивали через 24 час. Концентрацию цитокинов ИФН-γ и ИЛ-4, характеризующих функцию соответственно, Th1- и Th2-лимфоцитов [9, 12], определяли в периферической крови крыс через 4 и 7 сут. после первой инъекции ФОИ методом ферментного иммуносорбен-тного анализа (ELISA) [РОйт6], используя наборы (ELISA Kits) фирмы BioSource Int. Полученные данные обрабатывали статистически с использованием t-критерия достоверности Стьюдента.

Результаты исследования и их обсуждение

Под влиянием ФОИ происходило снижение гуморального иммунного ответа через 4 сут. по сравнению с контрольным уровнем к Т-зависимому антигену (по числу АОК в селезенке), характеризующему синтез IgM и функцию Th1-лимфоцитов (табл. 1). Так, ДДВФ, карбофос и метафос уменьшали данную реакцию соответственно, в 2,40; 2,04 и 2,14 раза (p < 0,05). Через 7 сут. отмечалась супрессия продукции IgG (по числу АОК в селезенке), отражающая преимущественно функцию Th2-лимфоцитов, при ДДВФ, карбофоса и метафоса, соответственно, в 1,60 (p < 0,05); 1,20 (p > 0,05) и 1,39 раза (p < 0,05). При отравлении этими интоксикантами отмечалась также существенная редукция активности ЕКК в 2,14; 1,79 и 2,23 раза (p < 0,05) и реакции ГЗТ в 2,15; 1,73 и 1,90 раза (p

Таблица 1. Влияние подострой интоксикации ФОИ (ежедневное подкожное введение в дозе 1/7 DL₅₀ в течение 6 сут.) на показатели системы иммунитета крыс ( n = 7-9)

Примечание : *⁾ различия достоверны при p < 0,05 по сравнению с контролем.

< 0,05) соответственно.

Согласно литературным данным, число АОК к ЭБ через 4 сут. характеризует синтез IgM В-лимфоцитами и функцию Th1-клеток. Активность ЕКК и формирование ГЗТ также свидетельствуют о способности Th1-лимфо-цитов влиять на данные реакции, а число АОК к ЭБ в реакции непрямого локального гемолиза в геле через 7 сут. отражает синтез IgG и функцию Th2-лимфоцитов [9-11]. Показатели, характеризующие различные иммунные реакции и связанную с ними функцию Th1- и Th2-лимфоцитов, при подостром действии ФОИ в среднем снижались в 2,06 и 1,40 раза соответственно. При этом, как уже упоминалось, Th1-лимфоциты подвергались действию ФОИ при введении токсикантов êðû ñàì â ñóì ì àðí î é äî çå 4/7 DL50, а Th2-лим-фоциты - в дозе 6/7 DL50. Это свидетельствует о том, что под влиянием ФОИ в существенно большей степени поражается функ- ция Th1-лимфоцитов.

Данное заключение подтверждается исследованием концентрации цитокинов в периферической крови крыс (табл. 2). При подострой интоксикации ДДВФ выявлено уменьшение концентрации ИФН- γ и ИЛ-4, на 5 сут. в 1,95 и 1,57 раза (p < 0,05), а на 8 сут. -в 1,86 и 1,44 раза (p < 0,05) соответственно. Действие карбофоса и метафоса вызывало в целом такую же редукцию исследованных параметров. Так, карбофос снижал концентрацию ИФН- γ и ИЛ-4 через 5 сут. в 1,80 и 1,38 раза (p < 0,05), а метафос - в 2,09 и 1,62 раза (p < 0,05) соответственно. В среднем через 5-8 сут. содержание в крови ИФН- γ и ИЛ-4 под влиянием ФОИ уменьшалось в 1,90 и 1,44 раза соответственно. Полученные данные свидетельствуют о том, что по сравнению с ИЛ-4 концентрация ИФН- γ в крови под влиянием ФОИ снижается в большей степени.

Таблица 2. Влияние подострой интоксикации ФОИ (ежедневное подкожное введение дозе 1/7 DL₅₀ в течение 6 сут.) на содержание цитокинов в периферической крови крыс, пг/мл ( n = 6)

Примечание: *⁾ 5, 8 – время исследования после иммунизации, сут; **⁾ различия достоверны при p <  0,05 по сравнению с контролем.

Известно, что ИФН-γ продуцируют Th1-лимфоциты, а ИЛ-4 – Th2-лимфоциты [9, 11, 13]. Увеличение соотношения ИФН-γ/ИЛ-4 характеризует снижение функциональной активности лимфоцитов Th2-типа по сравнению с функцией Th1-клеток [13]. Нами установлено, что на 5 и 8 сут. при действии ДДВФ соотношение ИФН-γ/ИЛ-4 было существенно ниже контрольного уровня (6,4) и составляло 5,1 и 4,9 соответственно. Аналогичные данные получены при действии других ФОИ. Это свидетельствует о более выраженной супрессии ФОИ функции Th1-лим-фоцитов. Вероятно, данный эффект обусловлен способностью ФОИ активировать гипо-таламо-гипофизарно-адреналовую систему, увеличивая в крови концентрацию кортикостерона. При этом известно, что данный гормон в большей степени снижает функцию лимфоцитов Th1-типа, по сравнению с Th2-лимфоцитами [9]. Возможно, что ФОИ способны ингибировать в большей степени аце-тилхолинэстеразу на клеточной мембране лимфоцитов Th1-типа и α-нафтил-АS-ацета-тэстеразу и α-нафтилбутиратэстеразу в цитозоле этих клеток [1, 3, 14], а также большей ролью эстераз в реализации функций лимфоцитов Th1-типа. Редукция активности ЕКК под влиянием ФОИ, по-видимому, связана со снижением продукции ИФН-γ Th1-клетками. Известно, что данные цитокины активируют ЕКК [9, 11, 12].

Выводы

Полученные результаты позволяют полагать [9, 12], что снижение функции лимфоцитов Th1-типа при отравлении ФОИ может увеличивать риск развития вирусных инфекций, а относительное повышение активности Th2-лимфоци-тов приводить к увеличению синтеза В-клет-ками IgE и формированию респираторных аллергических реакций.