Влияние гамма-излучения на содержание свободного пролина и малонового диальдегида в проростках ячменя обыкновенного

Активные формы кислорода (АФК) обладают высокой реакционной способностью и атакуют в непосредственной близости различные классы биомолекул, включая белки, ДНК и липиды. АФК приводят к перекисному окислению липидов, вызывая в остатках полиненасыщенных жирных кислот цепные реакции с образованием липидных радикалов L•, пероксилов LOO•, гид-ропероксилов LOOH• и алкоксилов LO•. В результате этих реакций жирные кислоты образуют целый спектр соединений: многие из них представляют собой альдегиды, которые обладают высокой биологической активностью и часто высокотоксичны. При распаде жирных кислот сначала образуются диеновые конъюгаты, а затем такие метаболиты как малоновый диальдегид (МДА) [1, 2].

Растения, как прикреплённые биообъекты, выработали многочисленные механизмы адаптации к стрессовым условиям. Они реализуются в комплексе на уровне интактного растения, на клеточном и молекулярном уровнях. Поскольку уровень стрессоустойчивости может в значительной степени меняться в онтогенезе, то приоритет механизмов также варьирует во времени.

Однако, в то же время известны осмотически активные соединения, которые при любых обстоятельствах способствуют поддержанию жизнедеятельности растений, действуя на различных уровнях. К таким соединениям относится, например, пролин – соединение, чьё накопление в организме растения помогает им адаптироваться к неблагоприятным условиям. Это происходит посредством участия пролина в защите клеточных компонентов, таких как белки, ДНК и ферменты, от потери активности [3]. Также значительную роль в защитных свойствах пролина играет то, что он способен нейтрализовать синглетный кислород и гидроксильный радикал. Когда растения подвергаются воздействию абиотических стрессоров: засоление, засуха, УФ-облучение, тяжёлые металлы и другое – происходит значительное увеличение концентрации пролина, что считается универсальным ответом на стресс [4].

Таким образом, целью исследования является изучение влияния гамма-излучения на содержание малонового диальдегида и свободного пролина в проростках Hordeum vulgare L.

Материалы и методы

Объект исследования. Для проведения эксперимента был выбран объект – ячмень обыкновенный ( Hordeum vulgare L.) трёх сортов: Витязь, Бадьорий и Ладны.

Источники ионизирующего излучения и условия облучения. Облучение семян проводили на базе НИЦ «Курчатовский институт» – ВНИИРАЭ (Обнинск) на уникальной научной установке «ГУР-120» (источник ионизирующего излучения – ⁶⁰Со) в дозах 2, 5, 10, 15, 20, 25 и 50 Гр. Мощность дозы составила 58 Гр/ч. Семена облучали в бумажных конвертах с площадью поверхности 25 см². В каждом конверте находилось по 30 семян, 3 конверта на каждую дозу гамма-облучения.

Тесты. После облучения семена проращивали в рулонных культурах в термостате при температуре 23,5 °С в темноте, на 5 сутки проращивания рулоны помещали под фитолампу Osram Fluora L 18W/77 (Германия), световой поток – 550 лм, мощность – 18 Вт. На 10 сутки измеряли количественное содержание свободного пролина и МДА с помощью фотометра КФК-3-01 (Россия). Содержание свободного пролина определяли по методу Бейтса с модификациями без использования толуола [5]. Определение МДА в тканях ячменя посевного проводили с помощью стандартного метода с тиобарбитуровой кислотой [6].

Каждая серия опытов повторялась 3 раза. Оценки средних значений и ошибок среднего проводили стандартными методами математической статистики с использованием пакета приложений Microsoft Excel 2016. Графические изображения созданы в программе SigmaPlot 11.0. В ходе статистической обработки для оценки достоверности различий использовали непараметрический расширенный критерий Манна-Уитни, при уровне значимости р<0,05. Анализ взаимосвязи признаков осуществлялся непараметрическим методом корреляционного анализа по Спирмену.

Результаты

В ходе эксперимента получены данные о зависимости содержания МДА в растительном материале от дозы гамма-излучения и выявлено, что у семян сортов Витязь и Ладны статистически значимое повышение уровня МДА происходит при облучении в дозах 2, 5, 10, 25 и 50 Гр (рис. 1 А,Б). Известно, что гамма-облучение в диапазоне доз от 10 до 20 Гр при мощности дозы 55-60 Гр/ч вызывает стимуляцию роста проростков ячменя [7, 8]. В нашей работе показано, что у облучённых семян сортов Витязь и Ладны в дозах 15 и 20 Гр количество МДА удерживается на уровне с контролем, что свидетельствует о нормализации процесса перекисного окисления липидов в проростках (рис. 1 А,Б). У пророщенных семян сорта Бадьорий процесс перекисного окисления липидов идёт интенсивнее при облучении в дозах 2, 20, 25 и 50 Гр (рис. 1 В).

Рис. 1. Зависимость содержания МДА в проростках ячменя посевного от дозы гамма-излучения на 10 сутки проращивания (А – сорт Витязь, Б – сорт Ладны, В – сорт Бадьорий).

* - статистически значимое отличие от контроля при р<0,05.

Есть основания считать, что при низких дозах облучения усиливаются свободнорадикальные процессы, представляя собой важный компонент фенотипической адаптации, так как увеличение уровня МДА может являться сигналом стресса у растений [9]. При воздействии ионизирующим излучением в дозах 15 и 20 Гр наблюдаются адаптивные реакции, выражающиеся в изменении антиоксидантной и гормональной систем, усилении работы пентозофосфатного пути, который участвует в защите от радиационно-индуцированного апоптоза. Так же происходит увеличение содержания каротиноидов, которые защищают биологические структуры, поглощая активные кислородные радикалы [10, 11]. С дальнейшим увеличением поглощённой дозы наблюдаются более серьёзные повреждения мембран, включая нарушение их функций и увеличение уровня МДА. Это приводит к деполяризации мембранного потенциала и сдвигу pH в кислотную сторону, что, в свою очередь, стимулирует синтез стрессовых белков [12].

Функциональная активность клеток изменяется из-за перестроек, возникающих в их мембранах, и подобные изменения сохраняются на протяжении длительного периода времени. Малые дозы ионизирующего излучения могут активировать мембранный механизм активации генома растений через системы трансдукции сигналов. В частности, через активацию аденилатциклазной и циклической аденозинмонофосфатной системы [13]. Мембранная регуляция происходит за счёт изменений в мембранном транспорте, активности мембранных ферментов, а также взаимодействия с ферментами и регуляторными белками. Все функции мембран, включая барьерную, транспортную, осмотическую, энергетическую и рецепторно-регуляторную, связаны с регуляцией внутриклеточного обмена веществ. Если барьерные свойства мембраны нарушаются, клетка теряет часть низкомолекулярных субстратов, что активирует метаболизм и влияет на активность ферментов репарации ДНК, что является неспецифической формой регуляции репарации ДНК [14]. Изменение проницаемости мембраны может стимулировать переход хроматина в новое состояние, что, в свою очередь, приводит к изменениям генной экспрессии и переключению клеток в новый режим работы в соответствии с генетической программой [15]. Конформационная структура хроматина позволяет клетке адекватно реализовывать экспрессию генов и изменения в структуре хроматина, и последующее изменение реализации генетической программы клетки приводит к различным эффектам, например, ускорению деления и дифференциации [16]. По современным представлениям действие ионизирующего излучения в тканях растений подавляется как через образование новых белковых комплексов, так и через распад старых. Снижение синтеза белка уже визуально заметно по замедленному росту растений, что обусловлено нарушением метаболических процессов и замедлении темпов развития растения. Сигнальной молекулой для подобного вида стресса можно считать аминокислоту пролин [17].

В настоящем исследовании выявлено, что при всех изученных дозах гамма-облучения содержание пролина резко возрастает по сравнению с контрольным уровнем. Исключением является гамма-облучение в дозе 15 Гр для сортов Витязь и Ладны (рис. 2 А,Б).

Рис. 2. Зависимость содержания свободного пролина в проростках ячменя посевного от дозы гамма-излучения на 10 сутки проращивания (А – сорт Витязь, Б – сорт Ладны, В – сорт Бадьорий). * - статистически значимое отличие от контроля при р<0,05.

В настоящее время хорошо изучены осмопротекторные характеристики аминокислоты пролин, её способности к стабилизации белковой структуры и регуляции рН цитоплазмы. Также известно, что пролин снижает содержание АФК и регулирует соотношение НАД и НАД-Н. Однако, для полного понимания молекулярного антиоксидантного действия пролина необходимы дополнительные исследования [18].

Несмотря на это, остаётся практически неизученным вопрос о том, как изменяется активность ферментов и низкомолекулярных компонентов антиоксидантной защиты в условиях повышения уровня пролина в растительной клетке. За последние годы появились сведения о том, что изменение внутриклеточной концентрации пролина под влиянием стресса может быть вовлечено в регуляцию активности антиоксидантных ферментов растений [19]. Это предполагает, что пролин играет важную роль в защите клеток от окислительного стресса, однако, механизмы его действия всё ещё требуют детального изучения.

В нашей работе также продемонстрирована корреляция между содержанием пролина и концентрацией МДА (коэффициент корреляции для сорта Витязь составил 0,871±0,121; для сорта Ладны – 0,892±0,103; для сорта Бадьорий – 0,886±0,112). Выявленная взаимосвязь свободного пролина и МДА хорошо коррелирует с данными, полученными другими авторами [19, 20].

Заключение

Таким образом, проведённое исследование влияния гамма-излучения в диапазоне доз от 2 до 50 Гр с мощностью дозы 58 Гр/ч на биохимические показатели ячменя посевного трёх сортов показало, что дозы гамма-облучения 15 и 20 Гр не повышают концентрацию МДА в ростках у сортов Витязь и Ладны, а у сорта Бадьорий – дозы гамма-облучения 10, 15 и 20 Гр. При облучении в стимулирующей рост и развитие растений дозе 15 Гр [8] концентрация пролина удерживается на уровне с контрольной группой для сортов Витязь и Ладны.

Стоит отметить, что вне зависимости от сорта динамика рассматриваемых показателей имеет схожий характер. Следовательно, полученные данные могут быть полезны как для оценки техногенного загрязнения аграрных экосистем, так и для исследований механизмов устойчивости растительных объектов к факторам внешней среды.