Влияние газотрансперсмиттеров на проницаемость мембран и активность тонопластной H + -АТФазы при окислительном стрессе

К сигнальным молекулам газообразных веществ (газотрансмиттерам) в настоящее время относят оксид азота (NO), сульфид водорода (H2S) и монооксид углерода (СО). Существует ряд критериев, которым соответствуют газотрансмиттеры: их молекулы должны существовать в виде газа и свободно проникать сквозь биологические мембраны (обладать липофильными свойствами), вырабатываться эндогенно (их синтез должен регулироваться ферментами), осуществлять определённые функции в физиологических концентрациях, иметь специфические клеточные и молекулярные мишени (Wang, 2002). Газотрансмиттеры являются высокотоксичными веществами, однако, несмотря на это свойство, они продуцируются практически всеми клетками любого организма, что указывает на высокую значимость данных молекул в регуляции жизнедеятельности клеток, тканей и организма в целом (Kaczorowski, Zuckerbraun, 2007). Участвуя в передаче сигнала, газотрансмиттеры вызывают физиологические и биохимические изменения в клетке (Jin et al., 2011). В настоящее время активно изучается их роль в поддержании сосудистого тонуса, ингибировании противовоспалительных сигнальных путей, апоптозе и др. процессах (Новицкий и др., 2011). Роль этих сигнальных молекул в метаболизме растений изучена меньше. Не вызывает сомнения, что она не менее существенна, чем у животных, и в настоящее время появилось значительное количество исследований, посвящённых этой теме. Наиболее изученной является роль NO в регуляции метаболизма и защите растительной клетки от стрессового воздействия (Besson-Bard et al., 2008). В последние годы начато изучение влияния других газотрансмиттеров на метаболизм растительной клетки. Так, уже показано, что H2S участвует в регуляции прорастания семян, морфогенезе корней, фотосинтезе и старении цветов, а также является важным участником в системах защиты растений против стрессового воздействия (Jin, Pei, 2015). CO также вовлекается в различные физиологические процессы, такие как прорастание и покой семян, закрытие устьиц, регуляция абиотических стрессов (He, He, 2014). Однако механизмы этих процессов ещё мало изучены. Известно, что в процессах жизнедеятельности клетки и организма в целом, активное участие принимают биологические мембраны. В связи с чем, целью нашей работы было исследование влияния газотрансмиттеров на проницаемость мембран растительной клетки, а также возможности влияния этих соединений на механизмы мембранного транспорта, в частности на активность протонной помпы вакуолярной мембраны (Н+-АТФазы) в норме и в условиях окислительного стресса.

MATERIALS AND METHODS

В качестве объекта исследования служили корнеплоды столовой свёклы (Beta vulgaris L.), которые находились на стадии покоя и хранились при +4ºС. Для настоящего исследования использовали как ткань корнеплодов, так и фракции вакуолей и везикул вакуолярных мембран. Изолирование вакуолей и последующее получение везикул вакуолярных мембран осуществляли с помощью метода (Саляев и др., 1981). Окислительный стресс создавали внесением в раствор пероксида водорода (Н2О2). Для этого к участкам ткани, нарезанным в форме дисков, в суспензию изолированных вакуолей или к осадку мембранных везикул добавляли 50 мМ Н2О2, после чего инкубировали 30 мин при комнатной температуре. Концентрация пероксида водорода, использованная в экспериментах, была предварительно подобрана (Озолина и др., 2014). В контрольном варианте инкубацию проводили в дистиллированной воде.

Для оценки устойчивости мембран к окислительному стрессу использовали кондуктометрический метод (Грищенкова, Лукаткин, 2005). Уровень повреждения клеточных мембран оценивали по выходу электролитов из тканевых дисков в дистиллированную воду с использованием кондуктометра (ОК-104, Radelkis) с платиновым электродом. В ходе эксперимента из ткани корнеплодов нарезали диски одинакового диаметра и толщины, которые в дальнейшем помещали в дистиллированную воду (контроль) или в 50 мМ раствор Н 2 О 2 (окислительный стресс). В течение 30 мин проводили инкубацию при комнатной температуре, после чего раствор сливали, а диски промывали и помещали в равный объём дистиллированной воды. Через сутки измеряли уровень выхода электролитов по электропроводности раствора в мкСм. Сразу после этого раствор с растительным материалом доводили до кипения, кипятили в течение 5 мин (для разрушения мембран) и давали ему остыть до комнатной температуры, затем объём доводили до исходной величины и вновь измеряли электропроводность раствора. Выход электролитов из тканей корнеплода столовой свёклы (V, % от полного выхода) рассчитывали по формуле: V

= 100 (L 1 /L 2 ), где L 1 – электропроводность образца после инкубации, L 2 – электропроводность того же образца после кипячения. Для изучения влияния газотрансмиттеров на выход электролитов из тканей корнеплодов в условиях нормы или окислительного стресса при 30 мин инкубации в воду (контроль) или 50 мМ раствор Н 2 О 2 (окислительный стресс) вносили источники газовых молекул: SNP (NO), NaHS (H 2 S) и CORM-3 (СО) в концентрации 100 мкМ. Концентрация газотрансмиттеров была выбрана после серии экспериментов, в которых были использованы и другие концентрации, но существенной разницы выявлено не было, поэтому в статье приведены данные с концентрацией 100 мкМ. Кроме того, эта концентрация обычно используется другими исследователями (Christou et al. , 2013).

Влияние окислительного стресса на барьерные свойства мембран (стабильность мембран) изучали с использованием экспериментальной установки собственного изготовления, позволяющей получать серии компьютерных изображений (цейтраферная видеосъемка, частота кадров 0.1 мин^-1 (1 кадр за 10 мин)), отражающих динамику процесса разрушения вакуолей (Нурминский и др., 2004). С помощью компьютерной обработки данных строили график зависимости количества сохранившихся вакуолей (%) от времени и рассчитывали значения периода полураспада изолированных вакуолей, в течение которого разрушаются 50% вакуолей (Т 1/2 ).

Уровень транспортной активности вакуолярной Н+-АТФазы оценивали по изменению рН везикул тонопласта при помощи флуоресцентного зонда акридинового оранжевого при длине волны возбуждающего и испускаемого света 493 и 540 нм, соответственно. Эксперименты проводили на спектрофлуориметре (RF-5301PC, Shimadzu). В кювету поэтапно вносили 2.5 мл инкубационного раствора и 0.05 мл осадка везикул тонопласта. Инкубационный раствор содержал: 20 мМ Трис/МЭС, 50 мМ KCl, 280 мМ маннит, 5 мкМ акридиновый оранжевый, 3 мМ MgCl2, рН 7.3. Содержание белка определяли по методу Бредфорд (Brеdford, 1976). В среднем на 0.05 мл образца приходилось 30–50 мкг белка. В среду инкубации вносили 3 мМ АТФ (Трис), а также источники газовых молекул: SNP (NO), NaHS (H2S) и CORM-3 (СО) также в концентрации 100 мкМ. Для доказательства специфичности проводимых исследований во всех экспериментах использовали общепринятый ингибитор Н+-АТФазы – бафиломицин (2 нМ), который подавлял активность этого фермента, а также протонофор 10 мкМ карбонилцианид 3-хлорофенилгидразон (CCCP), который полностью предотвращал тушение флуоресценции, возникающее при функционировании фермента. Транспортная активность измерялась в общепринятых единицах (%*Р/мг белка/мин), где ^F-тушение флуоресценции акридинового оранжевого (Braun et al., 1986). Средняя величина, полученная в контрольных экспериментах и принятая за 100%, при измерении транспортной активности Н+-АТФазы тонопласта равна 13,6 ±4,5 *Р/мг белка /мин.

В работе применяли следующие реактивы фирмы “Sigma”: 2-N-морфолино-этансульфоновую кислоту (МЭС), аденозинтрифосфат (АТФ, натриевая соль), Трис, 2-меркаптоэтанол, карбонилцианид 3-хлорофенилгидразон (СССР), гидросульфид натрия

(NaHS), CORM-3, бафиломицин А 1 , акридиновый оранжевый; фирмы “Fluka”: нитропруссид натрия (SNP), этиленгликоль-бис-(2-аминоэтил)-N,N,N,N-тетрауксусная кислота (ЭГТА). Остальные реактивы были отечественного производства квалификации ХЧ.

На графиках представлены средние арифметические значения величин и их стандартные отклонения, которые были получены в пяти-семи независимых экспериментах, рассчитанные с помощью программы Microsoft Excel.

RESULTS AND DISCUSSION

На первом этапе исследований проводилось изучение влияния газотрансмиттеров на выход электролитов из тканей корнеплодов в условиях нормы (рис. 1). Этот параметр позволяет оценить проницаемость клеточных мембран и их устойчивость к стрессу. При действии неблагоприятных факторов повышается утечка электролитов из тканей, что свидетельствует о нарушении избирательной проницаемости мембран растительной клетки (Приходько 1977). Это может быть связано с изменениями в структуре мембран, возникновением дефектов и стрессовых пор (Bertin et al., 1996). Результаты проведённых экспериментов показали, что только H2S оказывал небольшое влияние по снижению выхода электролитов из тканей корнеплода столовой свёклы, что позволяет предположить возможность стабилизирующего влияния этого газотрансмиттера на мембраны. Достоверного снижения выхода электролитов при влиянии других газотрансмиттеров обнаружено не было. Влияние газотрансмиттеров на проницаемость мембран может быть связано с тем, что они растворимы в липидах и могут оказывать влияние непосредственно на липидный бислой. Кроме того, было показано, что газотрансмиттеры принимают участие в регуляции ионных каналов (Scragg et al., 2008), что также может быть связано с их возможным влиянием на проницаемость мембран.

Для изучения влияния газотрансмиттеров на метаболические процессы растительной клетки было исследовано изменение транспортной активности Н+-АТФазы под воздействием этих соединений. Эта протонная помпа представляет собой один из наиболее важных ферментов, участвующих в процессах активного транспорта через вакуолярную мембрану. На долю Н+-АТФазы приходится до 15% всех белков тонопласта (Maeshima 2001), за счет чего обеспечивается поступление в вакуоль большого числа метаболитов (Martinoia, 2007).

Результаты этих экспериментов представлены на рис. 2. Они показывают, что достоверных отличий в изменении транспортной активности этого фермента ни один газотрансмиттер не вызвал, хотя небольшое снижение транспортной активности под влиянием NO и H 2 S все же было отмечено.

Известно, что газотрансмиттеры участвуют в механизмах защиты тканей и клеток от стрессового воздействия (He, He, 2014; Christou et al. , 2013). Для выяснения молекулярных механизмов участия газотрансмиттеров в защите растительной клетки от стрессового воздействия были проведены эксперименты по изучению влияния этих молекул на проницаемость клеточных мембран и на активность мембранных транспортных процессов в условиях окислительного стресса.

Чтобы оценить эффективность созданного стрессового воздействия, которое оказывал пероксид водорода на ткани корнеплодов столовой свёклы, было изучено его влияние на стабильность мембран с использованием метода цейтраферной видеосъёмки. В результате по полученным данным установили, что в условиях искусственно созданного окислительного стресса, период полураспада вакуолей уменьшался более чем в 2 раза (рис. 3), то есть темпы их разрушения были очень высокими и стресс действительно оказывал негативное воздействие на мембраны клеток корнеплодов. Кроме того, результаты, полученные кондуктометрическим методом, показали заметное увеличение выхода электролитов из тканей корнеплода (рис. 4), что говорит о значительных нарушениях структуры мембран, которые произошли в ответ на это стрессовое воздействие.

На следующем этапе наших исследований проводилось изучение влияния газотрансмиттеров на проницаемость мембран при окислительном стрессе. Так, кондуктометрическим методом, было установлено, что в условиях стресса газовые молекулы не способствовали снижению выхода электролитов, и, следовательно, защитной роли с их стороны выявлено не было (рис. 4).

Таким образом, полученные результаты показывают, что в зависимости от условий, исследуемые газотрансмиттеры оказывают различное действие на проницаемость клеточных мембран. Так, NO и СО не оказывали достоверного влияния ни в норме, ни в условиях стрессового воздействия. Тогда как молекулы H2S стабилизировали мембраны, уменьшая их проницаемость в условиях нормы, но в

Добавление газотрансмиттеров на фоне условиях окислительного стресса достоверного окислительного стресса оказывало заметное влияние влияния не оказывали (рис. 1 и 4).

на транспортную активность Н+-AТФазы (рис. 5). Так

Для оценки влияния окислительного стресса на молекулярном уровне было проведено изучение изменений, происходящих с транспортной активностью протонной помпы вакуолярной мембраны – Н+-АТФазой. Транспортная активность Н+-АТФазы в условиях окислительного стресса падает более чем на 40%, что говорит о существенном влиянии этого стрессового воздействия на механизмы мембранного транспорта (рис. 5). Было высказано предположение, что пероксид водорода вызывает окисление сульфгидрильных групп гидрофильного комплекса фермента, вследствие чего и происходит частичное инактивирование Н+-AТФазы (Seidel, 2012). Кроме, того на уровень активности протонной помпы могло оказать влияние изменение липидного окружения (Лось, 2013) при окислительном стрессе, что могло приводить к перестройке конформации фермента и добавление NO и H2S приводило к увеличению транспортной активности Н+-АТФазы, существенно сниженной воздействием пероксида водорода, однако не восстанавливали её полностью, тогда как СО усиливал негативное влияние стрессового воздействия в результате чего, транспортная активность Н+-АТФазы ещё больше снижалась. Поскольку газотрансмиттеры не оказывали влияния на транспортную активность Н+-AТФазы в норме (рис. 2), а оказывали влияние на активность этого фермента только в условиях окислительного стресса, можно предположить, что влияние газотрансмиттеров связано с такими изменениями в молекуле фермента или в её липидном окружении, которые вызывает окислительный стресс. С уменьшением негативного влияния окислительного стресса может быть в определённой степени связана защитная роль тем самым изменять его транспортную активность газотрансмиттеров, неоднократно показанная другими

_{(Палладина, Симчук, 1990).}                                   исследователями (Jin et al. , 2011; Zhang et al. , 2012).

Figure 1. Влияние газотрансмиттеров на выход электролитов из тканей корнеплода столовой свёклы (в % от полного выхода).

Figure 2. Влияние газотрансмиттеров на транспортную активность Н⁺-АТФазы.

Figure 3 . Влияние окислительного стресса на период полураспада изолированных вакуолей (Т 1/2 ).

Результаты получены методом цейтраферной видеосъемки.

контроль Н2О2 NO+H2O2 H2S+H2O2 СО+Н2О2

Figure 4 . Влияние газотрансмиттеров на выход электролитов из тканей корнеплода столовой свёклы в условиях окислительного стресса (в % от полного выхода).

Figure 5 . Влияние газотрансмиттеров на транспортную активность Н⁺-АТФазы в условиях

окислительного стресса.

CONCLUSION

Полученные результаты позволяют сделать вывод о возможности участия газообразных сигнальных молекул в регуляции транспортных процессов и в защитных механизмах растительной клетки при окислительном стрессе через влияние на активность Н+-AТФазы.

ACKNOWLEDGMENT

Исследование выполнено при финансовой поддержке РФФИ в рамках научных проекта № 14-0431080 мол_а. В работе использовалось оборудование Байкальского аналитического центра (ЦКП) ИНЦ СО РАН.