Влияние гетеротрансплантации костного мозга на продукцию нейромедиаторов его нейроамин-продуцирующими клетками

Воробьева О.В., Любовцева Л.А. Влияние гетеротрансплантации костного мозга на продукцию нейромедиаторов его нейроамин-продуцирующими клетками// Морфологические ведомости.- 2018.- Том 26.- № 4.- С. 7-10. (26).04.7-10 For the citation:

Vorob’еvа OV, Lubovtseva LA. The influence of the bone marrow xenotransplantation on producing of mediators by its neuroamine-producing cells. Morfologicheskie Vedomosti – Morphological Newsletter. 2018 Dec 30;26(4):7-10. (26).04.7-10

Введение . В последние десятилетия наблюдается тенденция к росту числа опухолевых процессов среди лиц молодого возраста. Участились случаи поражения костного мозга, поскольку клетки костного мозга обладают повышенной чувствительностью к различным воздействиям. Единственным способом оказания специализированной помощи таким пациентам является трансплантация костного мозга. Однако, в организме реципиента при введении чужеродного костного мозга развивается реакция «трансплантат против хозяина», вследствие этого гетеротрансплантация костного мозга не проводится. В настоящее время считается доказанным, что в регуляции костномозгового кроветворения приоритетное место принадлежит нейромедиаторам, синтезируемым гранулярными люминесцирующими клетками (далее – ГЛК) и тучными клетками (далее – ТК) [1-3]. На своей поверхности нейроамин-содержащие клетки (как ГЛК, так и ТК) имеют разнообразные рецепторы. В ГЛК и ТК синтезируются нейромедиаторы катехоламины, серотонин, гистамин при помощи которых эти клетки участвуют в регуляции дифференцировки и пролиферации большинства клеток костного мозга [1, 3-6].

Цель исследования – изучение числа гранулярных люминесцирующих и тучных клеток, продукции в них нейромедиаторов и корреляционный анализ их содержания после гетеротрансплантации.

Материалы и методы исследования. Опыты проводились на 60 белых мышах-самцах, массой 50-60 грамм. Животные распределились на 3 группы: 1-я – интактные животные, без введения костного мозга (далее – КМ, n=20); 2-я – контрольные животные (n=20), которым вводили 0,85% физиологический раствор в дозе 1 мл на кг массы тела; 3-я – опытная группа животных, которым вводили клеточную суспензию костного мозга кошки (n=20). Из эпифиза бедренной кости кошки путем аспирации извлекали 1 мл костного мозга, разводили в 2 мл 0,85% физиологического раствора, затем полученную суспензию вводили в хвостовую вену мышей. Криостатные срезы, полученные из эпифизов бедренной кости мышей, исследовали люминесцентно-гистохимическим методом Фалька-Хилларпа для определения катехоламинов (далее – КА) и серотонина (далее – СТ) [7]. Метод основан на реакции конденсации КА и СТ с формальдегидом, которые в результате дегидратации превращаются в интенсивно люминесцирующие вещества. С помощью люминесцентногистохимического метода Кросса с соавт. определяли гистамин [8]. Метод основан на реакции паров ортофталевого альдегида с гистамином, в ходе которой также образуется флуоресцирующее соединение. Метод спектро-флуориметрии применялся для определения содержания СТ, КА и гистамина в гранулярных люминесцирующих и тучных клетках КМ в условных единицах свечения (у.е.).

Корреляционный анализ использовался для выявления связей между содержанием нейроаминов парах КА-СТ, СТ- гистамин, КА-гистамин в ГЛУ и ТК КМ после гетеротрансплантации. Вычисление серотонинового индекса соотношения

СТ/КА проводилось для определения ведущей роли одного из нейромедиаторов (КА или СТ). При значении серотонинового индекса (далее – Is) больше единицы, можно предполагать преобладание в клетке содержания СТ. При значении Is меньше единицы в клетке преобладает содержание КА [9] . Статистическую обработку проводили с использованием пакета программ «Statistica 6.0». В работе приводятся следующие показатели: М – средняя арифметическая величина; σ – ошибка средней арифметической величины. Статистическую достоверность определяли критерием Стьюдента (t).

Результаты исследования и обсуждение. У мышей 2-й группы до 30 мин после введения физиологического раствора в хвостовую вену наблюдались изменения в содержании нейромедиаторов; через 30 мин показатели уравнивались с интактными мышами, в связи с этим данные учитывали у опытных животных начиная с 40-й минуты. При люминесцентно-гистохимическом исследовании в мазках костного мозга у интактных мышей определяются яркие ГЛК диаметром от 13 до 22 мкм, имеющие амебовидную форму, с гранулами разного размера и цвета. Чаще всего ГЛК расположены около островков размножения по ходу нервных волокон. ТК определяются как мелко-гранулярные округлые клетки диаметром от 9 до 18 мкм с зелеными люминесцирующими гранулами. ТК располагаются около островков размножения одиночно либо в составе групп клеток в которые входят ГЛК, ТК, ретикулярные клетки, макрофаги, липоциты, образующих в КМ комплексы. Рядом с ними располагаются группы вновь образующихся клеток эритроидного и нейтрофильного рядов.

У мышей 3-й опытной группы через 40 мин после гетеротрансплантации КМ, отмечается тенденция к уменьшению числа ГЛК, однако содержание КА и СТ в них повышено (табл. 1). Число ТК в 1,5 раза превышает показатели интактных животных. Отмечается увеличение содержания КА до 21,7±0,6 у.е. (у интактных – 18,6±0,6 у.е.), но содержание СТ в

Таблица 1

Показатели содержания серотонина в клетках костного мозга в условных единицах свечения ( М±а )

Клетки	Сроки после трансплантации костного мозга
	Контрольная группа	40 мин	60 мин	4 часа	1 сутки	2 суток
ГЛК	14,1±0,8	40,1±3,8	32,2±0,8	3,2±0,5	17,5±1,5	-
ТК	21,3±0,9	11,5±2,7	44,2±3,7	8,3±4,7	3,4±0,3	-

них уменьшается (табл. 1). При изучении содержания гистамина выявлено его снижение в ГЛК до 15,7±0,5 и в ТК до

27,8±0,5 у.е. по сравнению с интактными (31,6±0,7 и 28,1±0,6 у.е., соответственно). Некоторые ТК были дегранулированы, что приводит к усилению люминесценции межклеточного пространства. Усиленно люминесцируют эритроциты, что указывает на наличие гистамина в них, эта особенность не выявляется у мышей 1-й группы. Это связано с тем, что эритроциты адсорбируют межклеточный гистамин.

Через 60 мин после гетеротрансплантации КМ в ГЛК и ТК отмечено еще большее повышение КА и СТ. Содержание гистамина сохраняется уменьшенным, как в ГЛК, так и в ТК. Однако, некоторые гемопоэтические клетки имеют высокое содержание гистамина (табл. 1). Через 4 часа отмечается дальнейшее увеличение содержания КА до 53,1±0,7 в ГЛК и до 28,6±0,7 у.е. в ТК. Однако, содержание СТ в них начинает резко уменьшаться. Число ГЛК и

Таблица 2

Корреляционные связи между содержанием нейромедиаторов в нейроамин-продуцирующих клетках костного мозга после гетеротрансплатации

Клетки	Корреляционные пары	Интактные животные	40 мин	4 часа	1 сутки
ГЛК	КТ/СТ	-0,9	-0,7	-0,06	0,3
	СТ/гистамин	0,4	0,9 *	0,09	-0,2
	КА/гистамин	-0,5	0,8 *	0,6	0,6
	Is	0,9	0,9	0,06	5,8
ТК	КА/СТ	0,9	0,5	-0,3	-0,5
	СТ/гистамин	0,8	-0,7	0,4	0,98 *
	КА/гистамин	-0,7	-0,7	0,7	0,5
	Is	1,09	2	0,3	0,5

Примечание: * - статистическая значимость коэффициента корреляции, р<0,05

ТК в костном мозге через 4 часа после гетеротрансплантации уменьшается. Отмечаются разнонаправленные показатели содержания гистамина в нейроамин-продуцирующих клетках – снижение в ГЛК и резкое его повышение в ТК. Через 1 сутки некоторые ГЛК определяются распавшимися, образующими скопление люминесцирующих гранул в срезах костного мозга. В сохранных ГЛК отмечается понижение содержания КА до 5,1±0,5 у.е., в ТК до 7,3±0,5 у.е. Аналогичное снижение гистамина выявлено в ГЛК до 3,2±0,5 у.е. и в ТК до 7,4±0,2 у.е. Однако, содержание СТ к этому сроку сохраняется повышенным (табл. 1). В отличие от интактных мышей, большинство ТК костного мозга мышей экспериментальных групп имеют меньшие размеры, возможно, это компактные формы клеток с низким содержанием КА и СТ. В пересаженном костном мозге увеличивается число липоцитов от 7 до 8 (рис. 1), у интактных их число составляет от 1 до 2 клеток. Более того, около них

определяются мелкие, компактные, тучные клетки. Через 2-е суток сохранные ГЛК и ТК в костном мозге не определяются, выявляются лишь единичные люминесцирующие гранулы, отмечается диффузное свечение в межклеточном пространстве.

При исследовании корреляционных связей в парах содержания нейромедиаторов установлено, что через 40 минут после гетеротрансплантации КМ в ГЛК в парах содержания СТ-гистамин и КА-гистамин определяются сильные положительные статистически значимые связи (до +0,9), что указывает на одновременное влияние этих нейромедиаторов на гемопоэтические клетки. В ТК определяются отрицательные корреляционные связи содержания в парах СТ-гистамин и КА-гистамин (р<0,05), что вероятно указывает на выделение в межклеточное пространство только одного нейромедиатора в результате конкурентного вытеснения (табл. 2). Ко 2-м суткам эксперимента все корреляционные связи между содержанием нейромедиаторов в клетках нарушаются и полностью исчезают, что указывает на отсутствие их влияния на клетки костномозгового кроветворения [4, 10] .

Показатель серотонинового индекса до 40 мин эксперимента увеличивается до двух единиц в ТК, а в дальнейшем становится меньше единицы. По условиям метода снижение серотонинового индекса менее единицы указывает на то, что нейромедиаторный механизм регулирования пролиферации гемопоэтических клеток с помощью ГЛК и ТК нарушается [4, 10-

Заключение. Таким образом, установлено, что в условиях эксперимента после ксенотрансплантации костного мозга в течение 40 минут происходит повышение содержания нейромедиаторов в его ГЛК и ТК, а также в нем увеличивается число нейроамин-продуцирующих клеток. В последующие сроки происходит дегрануляция ТК с тотальным распадом, а также выброс нейромедиаторов из гранул ГЛК, вследствие этого отмечается диффузная люминесценция межклеточного пространства, увеличивается число липоцитов. Как известно, белая жировая ткань адсорбирует на себе катехоламины, серотонин, гистамин [4] . Поскольку нейроамины участвуют в делении и дифференцировке клеток, липоциты в ответ на введенный чужеродный антиген адаптационно накапливают нейромедиаторы, тем самым защищая организм от размножения чужеродных клеток. Таким образом гетеротрансплантация костного мозга на ранних сроках эксперимента способствует увеличению нейромедиаторов в его ГЛК и ТК. После 4 часов, начала эксперимента происходит разрушение этих клеток, наблюдается постепенное увеличение числа липоцитов, в них нарушаются корреляционные соотношения содержания нейромедиаторов.