Влияние гипобарической барокамерной гипоксии на состояние гепатоцитов крыс с неалкогольной жировой дистрофией печени

Бюллетень науки и практики / Bulletin of Science and Practice

УДК 612.357.6-092.9(23.01+23.03)                    

Проблема неалкогольной жировой дистрофии печени (НЖДП) приобрела особую актуальность в связи с широким распространением среди населения во всем мире. Это дало основание трактовать НЖДП как не инфекционную эпидемию [1, 2]. Так установлено, что у 34% взрослого населения США и 29% Японии отмечается избыточное отложение жира в печени, не связанное со злоупотреблением алкоголя [3, 4]. В Российской Федерации масштабное эпидемиологическое исследование выявило неалкогольную жировую болезнь печени (НАЖБП) у 37,3 [5, 6]. Механизмы накопления жиров в гепатоцитах до конца не раскрыты. Определенная роль в этом процессе отводится инсулинорезистентности, которая влечет за собой гиперпродукцию триглицеридов в печени [7]. От функционального состояния печени в значительной степени зависит динамическое постоянство гомеоморфоза и гомеокинеза других органов и гомеостаза организма в целом. Главным условием, поддерживающим метаболические процессы на адекватном уровне в организме, в том числе в печени, является бесперебойное обеспечение кислородом [8]. Влияние гипоксии на гепатоциты имеет многоконтурный характер. Согласно одним данным [9], гипоксия усиливает экспрессию HIF-1α и NF-kappaB, тем самым стимулирует активацию звездчатых клеток печени, увеличивает ангиогенез, эпителиально-мезенхимальный переход, опосредует хроническое воспаление и генетическую модификацию; в итоге возникает и развивается фиброз печени. По другим данным [10, 11] чрезмерное потребление продуктов, содержащих липиды, способствует β-окислению жирных кислот, для чего требуется значительное количество кислорода. Сужение синусоидов печени из-за набухания гепатоцитов сопровождается гипоксией печени и провоцирует НЖДП. Одновременно есть мнение, что гипоксическая гипоксия может стимулировать функцию митохондрий и стать новой стратегией лечения НЖДП [12].

Поэтому, целью сообщения является изложение результатов исследования влияния гипобарической гипоксии на структурную организацию печени крыс, страдающих НЖДП.

Материалы и методы

Работа выполнена на 180 беспородных крысах-самцах массой 150–200 г. Перед началом эксперимента животных разделили на 2 серии: контрольную, где животные содержались на диете по Ackerman, состоящую из 21% белков (порошковый казеин), 5% жиров (топленое говяжье сало), 60% углеводов (кристаллическая фруктоза), 14% зернового корма (8% целлюлозы, 6% минеральной смеси и витаминов) [13] и основную, в которой животные находящиеся на идентичной диете [13], одновременно подвергались действию барокамерной гипоксии (Таблица 1).

Таблица 1

РАСПРЕДЕЛЕНИЕ ЖИВОТНЫХ В ЭКСПЕРИМЕНТЕ

Серии
Контрольная (г.Бишкек, 760 м над ур.моря)	Барокамерная (6000 м над ур.м)
Группы
I группа – интактные животные (n=20)	Iа – группа –интактные животные (n=20)
II группа – животные, находящиеся в течении 35-и дней на модифицированной диете по Ackerman (n=30)	IIа группа – животные, находящиеся в течении 35-и дней на модифицированной диете по Ackerman (n=30)
III группа – животные, находящиеся в течении 70-и дней на модифицированной диете по Ackerman (n=30)	IIIа группа – животные, находящиеся в течении 70-и дней на модифицированной диете по Ackerman (n=30)

Для изучения закономерностей сложной формы адаптации печени к предъявленной диете и прерывистой гипоксии в эксперименте использовалась климатическая барокамера.

При этом имитировался подъем на высоту 6000 м над ур. м. со скоростью 3,3 км/ч, а время экспозиции составило 6 часов, продолжительность эксперимента 35 и 70 суток. По истечении срока опытов животных декапитировали, проводили патологоанатомическое исследование и забор материала. Кусочки печени фиксировались в 10% растворе формалина, проводились по спиртам возрастающей концентрации, заливались в парафин, изготавливались гистологические препараты, окрашенные гематоксилин-эозином и по Ван-Гизону. Экспериментальные вмешательства проводились с соблюдением правил лабораторной практики, утвержденной приказом министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации от 23 августа 2010 г. №708 Н «Об утверждении правил лабораторной практики». Протокол исследования одобрен локальным этическим комитетом при НПО «Профилактическая медицина МЗ КР.

Готовые гистологические препараты изучались под микроскопом Olympus B×40 (Япония) одновременно проводились фотосъемка с протоколированием регистрируемых данных. Морфометрия осуществлялась при помощи встроенной компьютерной программы Top View.

Площадь гепатоцита рассчитывалась по формуле:

• $ _ 3х7зха , ^е а — Диаметр гепатоцита;

Объем ядра гепатоцита определяли по формуле:

• V = ~ ^( ~ ) 3 , где d — диаметр ядра.

Статистическая обработка данных проводилась в программе SPSS 16.0.

Результаты и обсуждение

Среди животных, находящихся 70 суток на диете по Ackerman в сочетании с действием барокамерной гипоксии, падеж животных составил 16%, а в группе контроля — 7%. Крысы IIIа группы отличались редкой, тусклой на вид шерстью, цианотичной мордочкой, исхуданием и малым весом, с потерявшими блеск глазами, отсутствием внутренностного и подкожного жира, тонкими и слабо развитыми мышцами. Не смотря на достаточное питание их желудочно-кишечный тракт был пуст, а печень отличалась не естественной окраской с явлениями застойного полнокровия, в то время как у животных, находящихся на названной диете в течение 35-и суток макроскопически печень характеризовалась увеличенными размерами, мелкозернистой бугристой поверхностью и бледноватым цветом.

Микроскопически в пределах классической дольки печени у крыс, находящихся на модифицированной диете Ackerman, на 35 сутки эксперимента отмечаются нарушения балочного строения с явлениями вакуолизации цитоплазмы гепатоцитов, достоверно значимое увеличение их площади на 70% без существенных изменений ядер (Таблица 2, Рисунок 1).

Таблица 2 ИЗМЕНЕНИЕ МОРФОМЕТРИЧЕСКИХ ПОКАЗАТЕЛЕЙ ПЕЧЕНИ У КРЫС, НАХОДЯЩИХСЯ НА МОДИФИЦИРОВАННОЙ ДИЕТЕ ACKERMAN Площадь гепатоцита (нм2) Объем ядра гепатоцита (нм3) I группа 6472,09±210,5 10514,49±437,03 II группа 11018,57±522,64** 10224,77±652,79 III группа 12006,16±575,75*** 15832,60±1011,06*** Примечание: P<0,05. Значения достоверны в группе животных на жирной диете в сравнении с контролем

К 70 дню эксперимента площадь гепатоцитов увеличивается на 85%, а объем ядра — на 50% от исходных значений. Регистрируется выраженная жировая дистрофия гепатоцитов, а в отдельных участках — некротические повреждения гепатоцитов.

Рисунок 1. Изменение морфометрических показателей печени у крыс, находящихся на модифицированной диете Ackerman (%)

В синусоидах классической печеночной дольки визуализируется сепарация форменных элементов и плазмы с преобладанием плазменного компонента. Строма и межбалочные пространства отечные. В условиях барокамерной гипоксии (Таблица 3, Рисунок 2) у животных на 35 день эксперимента отмечается увеличение площади гепатоцитов на 30% (P<0,05), а объема ядра — на 5%. На 70 сутки площадь гепатоцитов увеличивается на 7%, а объем ядра — на 41%(P<0,001) в сравнении с аналогичными показателями контроля. Отмечается наличие безъядерных гепатоцитов (Рисунок 3).

ИЗМЕНЕНИЕ МОРФОМЕТРИЧЕСКИХ ПОКАЗАТЕЛЕЙ ПЕЧЕНИ У КРЫС, НАХОДЯЩИХСЯ НА МОДИФИЦИРОВАННОЙ ДИЕТЕ, ПОДВЕРГШИХСЯ БАРОКАМЕРНОЙ ГИПОКСИИ

Таблица 3

	Площадь гепатоцита (нм2)	Объем ядра гепатоцита (нм3)
Iа группа	8416,7±290,88	12318,68±431,17
IIа группа	10930,80±535,50**	12958,99±655,01
IIIа группа	9057,76±371,6	17396,86±743,26***

Примечание: **P<0,05, ***P<0,001. Значения достоверны в группе животных на модифицированной диете Ackerman в сравнении с соответствующим результатом в контрольной группе

Рисунок 2. Изменение морфометрических показателей печени у крыс, находящихся на модифицированной диете Ackerman в условиях барокамерной гипоксии (%)

Рисунок 3. Кареолизис в гепатоцитах (гематоксилин-эозин, ув. 400)

Рисунок 4. Гиперкапилляризация и полнокровие сосудов печени, сладжирование эритроцитов по типу монетных столбиков (гемотоксилин-эозин, ув. 400)

Как видно из Таблицы 4 и Рисунка 5, у животных, которые в течение 35-и суток находились на модифицированной диете по Ackerman и при этом подвергались действию барокамерной гипоксии отмечается увеличение объема ядра на 26% (P<0,05), и тенденция к снижению площади гепатоцита.

Таблица 4

СРАВНИТЕЛЬНЫЙ АНАЛИЗ МОРФОМЕТРИЧЕСКИХ ПОКАЗАТЕЛЕЙ ГЕПАТОЦИТОВ НА МОДИФИЦИРОВАННОЙ ДИЕТЕ ACKERMAN

У КРЫС НИЗКОГОРЬЯ И БАРОКАМЕРНОЙ ГИПОКСИИ НА 35-Е СУТКИ (нм)

	Низкогорье		Барокамера
	Интактные животные	Диета по Ackerman	Интактные животные	Диета по Ackerman
Площадь гепатоцита (нм2)	6472,09±210,5	11018,57±522,64	8416,7±290,88**	10930,80±535,50
Объем ядра гепатоцита (нм3)	10514,49±437,03	10224,77±652,79	12318,68±431,17**	12958,99±655,01**

Примечание: **P<0,05. Различия достоверны у животных, подвергшихся подъему в барокамере по сравнению с низкогорной серией

Микроциркуляторное русло печени в группе IIIа характеризуется гиперкапилляризацией и полнокровием; признаками реологических нарушений в виде сладжирования форменных элементов крови (Рисунок 5). На 70 сутки сочетанного действия модифицированной диеты по Ackerman и барокамерной гипоксии (Рисунок 6, Таблица 5) площадь гепатоцитов снижается на 25% (P<0,001), объем ядра имеет тенденцию к увеличению.

Процессы отложения гликогена, поставки энергетических субстратов тканям, реализуемые печенью, требуют значительного количества кислорода, что вызывает резкий градиент его во всех печеночных долях. Измененный печеночный метаболизм и ремоделирование тканей при НЖДП еще больше нарушают кислородный гомеостаз печени, что приводит к тяжелой гипоксии. Факторы, индуцируемые гипоксией (HIF), играют центральную роль в адаптации клеток и тканей к гипоксии. Являясь главными регуляторами адаптивных реакций на гипоксический стресс, индуцируемые гипоксией факторы (HIFS)

модулируют клеточные и органные функции, включая эритропоэз, ангиогенез, метаболическую потребность и выживание клеток.

130 117

низкогорье барокамера низкогорье (интактные) (интактные) (диета 35 суток)

барокамера (диета 35 суток)

■ Площадь гепатоцитов ■ Объем ядра

Рисунок 5. Сравнительный анализ морфометрических показателей гепатоцитов на модифицированной диете Ackerman у крыс низкогорья и барокамерной гипоксии на 35 сутки (%)

Таблица 5.

СРАВНИТЕЛЬНЫЙ АНАЛИЗ МОРФОМЕТРИЧЕСКИХ ПОКАЗАТЕЛЕЙ ГЕПАТОЦИТОВ НА МОДИФИЦИРОВАННОЙ ДИЕТЕ ACKERMAN

У КРЫС НИЗКОГОРЬЯ И БАРОКАМЕРНОЙ ГИПОКСИИ НА 70 СУТКИ (нм)

	Низкогорье		Барокамера
	Интактные животные	Диета по Ackerman	Интактные животные	Диета по Ackerman
Площадь гепатоцита (нм2)	6472,09±210,5	12006,16±575,75	8416,7±290,88**	9057,76±371,6***
Объем     ядра гепатоцита (нм3)	10514,49±437,03	15832,60±1011,06	12318,68±431,17**	17396,86±743,26

Примечание: ***P<0,001. Различия достоверны у животных, подвергшихся подъему в барокамере по сравнению с низкогорной серией.

130 117

низкогорье (интактные)

барокамера низкогорье    барокамера

(интактные) (диета 70 суток)(диета 70 суток)

• ■ Площадь гепатоцитов ■ Объем ядра

Рисунок 6. Сравнительный анализ морфометрических показателей гепатоцитов на модифицированной диете у крыс низкогорья и барокамерной гипоксии на 70-е сутки (%).

Выводы:

• 1.    У крыс, находящихся на модифицированной диете по Ackerman к 35 суткам эксперимента в гепатоцитах формируются стойкие изменения, характерные для неалкогольной жировой дистрофии печени.

• 2.    Развитие неалкогольной жировой дистрофии печени в эксперименте приводит к значительному увеличению площади гепатоцитов (на 70% на 35 сутки и на 85% на 70 сутки), при этом объем ядер подвергается увеличению на 50% только к 70-м суткам эксперимента.

• 3.    Барокамерная гипоксия снижает явления клеточной инфильтрации, что выражается отсутствием выраженного увеличения площади гепатоцитов, однако объем ядра нарастает на 41%.