Влияние глюкозы на морфофункциональные свойства хондроцитов in vitro

Суставной хрящ представляет собой высокоспециализированную плотную соединительную ткань, и может рассматриваться как композитный гель с относительно малым содержанием (5 %) клеток, хондроцитов, внедренных во внеклеточный матрикс [7]. Хондроциты являются единственным типом клеток в суставном хряще и отвечают за биосинтез и катаболизм внеклеточного матрикса.

Внеклеточный матрикс гиалинового хряща главным образом состоит из коллагена типа II (COL2A1) и аггрекана (ACAN) [2]. Эти составляющие обеспечивают скольжение внутри суставов, наименьшее трение и повышенный уровень износоустойчивости [1; 6]. Коллаген типа II является основной макромолекулой внеклеточного матрикса, которая обеспечивает структурную поддержку хряща. Его усиленная деградация и последующая потеря с сопутствующей эрозией хряща является ключевой характеристикой остеоартроза – самого распространенного заболевания хрящей.

Остеоартроз имеет множество независимых факторов риска, среди которых есть сахарный диабет. Это позволяет нам выдвинуть гипотезу, что различные концентрации глюкозы могут оказывать огромное влияние на морфофункциональные свойства хондроцитов в целом и на образование остеоартроза в частности.

Известно, что глюкоза является важной метаболической молекулой для дифференцированных хондроцитов как в постнатальном развитии, так и во взрослом суставном хряще, и является общим структурным предшественником для синтеза гликозаминогликанов внеклеточного матрикса. Было показано, что внеклеточная концентрация глюкозы, как повышенная, так и пониженная, непосредственно влияет на некоторые функции хондроцитов [4].

Несмотря на многочисленные исследования, до сих пор остается открытым вопрос о влиянии глюкозы на функции клеток хряща. В настоящее время подробно изучены аспекты механизма переноса глюкозы белками-транспортерами в суставном хряще. Также известно, что производные глюкозы, такие как сорбит и диацилглицерин, участвуют в активизации провоспалительных цитокинов, приводя к усилению воспаления при ОА [3]. Однако изучение морфофункциональных изменений хондроцитов под влиянием различных концентрация глюкозы представляет актуальную задачу, ведь это позволит использовать полученные знания в клинических целях.

Цель работы – выявить закономерностей влияния глюкозы на морфофункциональные свойства хондроцитов in vitro .

Материалы и методы

Выделение клеток

Содержание животных и выведение их из опыта осуществляли на основе 65 «Правил проведения работ с использованием экспериментальных животных» и Директивы 2010/63/ EU Европарламента и Совета ЕС по охране животных, используемых в научных целях.

Механическим путем происходило выделение хрящевой ткани из тазобедренных и коленных суставов крыс предварительно отделяя от кости и очищая от волокон мышц стерильным скальпелем. Перед тем как перейти к самому выделению клеток хондроцитов, хрящевую ткань стерилизовали, протирая 70 % этиловым спиртом, а хондроциты выделяли ферментативным путем и для увеличения количества жизнеспособных использовался 3-этапный алгоритм выделения [1].

Суспензию хондроцитов, полученных с трех этапов, переносили дозирующим устройством в 6-лунковые планшеты (6 Well Cell Culture Plate, USA) плотностью 5*10 ⁴ клеток/ мл для достижения монослойной культуры, плотно закрывали и обматывали парафильм-ной пленкой для предотвращения высыхания культуры и ее сохранения.

Культивирование хондроцитов при разной концентрации глюкозы

Для изучения влияния глюкозы на морфофункциональные характеристики хондроцитов клетки культивировали в среде с добавлением разных концентраций глюкозы, а также при ее отсутствии. Соответственно, полученную суспензию хондроцитов разделили на

4 группы по концентрации глюкозы: 0; 1,5; 5; 25 мМ. В каждой группе были хондроциты, выделенные из 6 суставов. Инкубировали в течение 7 дней при 37 °C.

Морфологические методы

Для выявления морфологических признаков хондроцитов проводили окрашивание по Романовскому – Гимзе. Для определения количества и жизнеспособности клеток использовали методы световой и флуоресцентной микроскопии. Количество живых клеток определяли с помощью окрашивания трипановым синим и использованием камеры Горяева. Для окрашивания смешивали 900 мкл 0,4 % раствора трипанового синего с 100 мкл клеточной суспензии, то есть разведение 1:10. Тщательно перемешивали и инкубировали в течение 5 минут при комнатной температуре. Далее подсчитали неокрашенные (жизнеспособные) и окрашенные (мертвые) клетки в камере Горяева и определили процент жизнеспособных клеток по формуле (1):

- (%) = xl- * 100, x

где l (%) – процент жизнеспособных клеток; xl – количество живых (неокрашенных) клеток; x – общее количество клеток.

Расчет числа клеток осуществляли по формуле (2).

X =

4000b) a *------1*1000, c )

где a – сумма клеток, подсчитанная в 5 больших квадратах сетки; b – разведение исходного субстрата; с – число малых квадратов, в которых производился подсчет; X – количество клеток в 1 мл.

Также для оценки жизнеспособности использовался флуоресцентный метод. В лунки планшета с суспензией хондроцитов добавляли по 2 капли реагента из набора флуоресцентных красителей Cell Viability Imaging Kit, Blue/ Green (Thermofisher scientific). Фиксировали 15 минут. Клетки окрашивались зеленом цветом реагентом NucGreen, который окрашивал только ядра клеток с нарушенной целостнос- тью плазматической мембраны и определялся стандартным фильтром GFP, а ядра целых неповрежденных клеток окрашивались NucBlue и обнаруживались при DAPI.

Расчет ядерно-плазматического показателя осуществляли с использование программы ImageJ (США) путем измерения площади всей клетки и площади ядра. Показатель рассчитывался по формуле (3):

P = ^{S об} , (3)

Sя где P – ядерно-цитоплазматический показатель; Sоб – общая площадь клетки; Sя – площадь ядра.

Протеогликаны в культуральной среде выявляли и количественно подсчитывали с помощью красителя сафранина О. Каплю питательной среды инкубировали в течение 5 мин с красителем в соотношении 1:1. После инкубации наносили на предметное стекло и рассчитывали площадь интенсивно окрашенных участков с использованием программного пакета ImageJ (США).

Статистические методы

Количественные данные обрабатывали с помощью программы Statistica 12.0 (StatSoft Inc., США) с расчетом показателей, принятых для характеристики непараметрических выборок в медико-биологических исследованиях: нормальность распределения значений, медиана [1-й квартиль, 3-й квартиль] и оценивали достоверность различий выборок [6]. Для анализа различий между выборками использовали критерий Манна-Уитни при достоверности p = < 0.05.

Результаты и их обсуждения

Морфологические изменения параметров хондроцитов в условиях изменения концентрации глюкозы в питательной среде описаны в таблице.

Видна положительная зависимость показателя жизнеспособности от интактной группы до концентрации 5 мМ. Однако при концентрации глюкозы 25 мМ жинеспособность клеточной культуры резко падает ниже показателей интактной группы, что свидетельствует о негативном влиянии повышенных концентраций внешней глюкозы на клетки суставного хряща (см. рис. 1). Однако полное отсутствие внешней глюкозы в питательной среде также приводит к снижению жизнеспособности клеток, что, в свою очередь, влияет на количество синтезируемых протеогликанов (см. рис. 2). Последующие нарушения метаболизма в суставном хряще могут привести к развитию такого заболевания, как остеоартроз.

Нами зафиксирована положительная зависимость размеров клетки от концентрации глюкозы в питательной среде. Так как оценка жизнеспособности культуры показала, что при концентрации глюкозы в питательной среде 25 мМ количество живых хондроцитов резко снижается, то есть основания полагать, что мог быть включен процесс, называемый ги-петрофией клеток. Также увеличение размеров клетки может быть связано с активным синтезом продуктов, однако анализ содержания количества протеогликанов в каждой лунке говорит об обратном [5]. Исходя из этого, можно предположить, что увеличение клеток

Морфофункциональные свойства хондроцитов in vitro

Показатель	Интакт	Концентрация глюкозы в питательной среде
		1,5 мМ	5 мМ	25 мМ
Жизнеспособность	0,59 [0,56 ÷ 0,75]	0,68# [0,67 ÷ 0,73]	0,80*# [0,79 ÷ 0,81]	0,57# [0,50 ÷ 0,65]
Площадь клеток, мкм2	96,58 [84,43 ÷ 122,02]	139,90*# [120,16 ÷ 160,22]	160,80*# [121,32 ÷ 175,89]	189,24*# [159,64 ÷ 210,14]
Ядерно-цитоплазмати-ческий показатель	0,14 [0,11 ÷ 0,17]	0,18* [0,15 ÷ 0,20]	0,17 [0,14 ÷ 0,22]	0,15 [0,13 ÷ 0,19]
Количество 2 протеогликанов, мкм	63,06 [21,84 ÷ 97,48]	129,81*# [94,96 ÷ 155,26]	159,34*# [124,45 ÷ 213,67]	129,51*# [69,93 ÷ 175,76]

Примечание. * – достоверные различие p < 0,05 между экспериментальной и интактной группами, # – достоверные различие p < 0,05 между экспериментальными группами, при использовании критерия Манна – Уитни.

происходит не из-за увеличения синтеза протеогликанов, а из-за активации процессов гибели клеток.

Несмотря на это, глюкоза, наоборот, стимулирует увеличение плотности внутриклеточного матрикса, что тоже не является противоречием, так как относительно интакта в экспериментальной группе с содержанием 5 мМ глюкозы в питательной среде содержалось в 2 раза больше протеогликанов. Более того, при высоких концентрациях внешней глюкозы отмечено уменьшение плотности матрикса, что мы также можем наблюдать на результатах эксперимента (рис. 2).

Рис. 1. Результат окрашивания клеточной культуры на жизнеспособность красителем Cell Viability Imaging Kit, Blue/Green ( А – интактная культура клеток суставного хряща; Б – культура клеток, культивируемая с добавлением концентрации глюкозы 1,5 мМ;

В – культура клеток, культивируемая с добавлением концентрации глюкозы 5 мМ;

Г – культура клеток, культивируемая с добавлением концентрации глюкозы 25 мМ).

Линейка масштаба 400 мкм

Рис. 2. Окрашивание сафранином О на содержание протеогликанов при разной концентрации глюкозы в питательной среде ( А – интакт; Б – количество протеогликанов при культивировании клеток в 1,5 мМ глюкозы; В – количество протеогликанов при содержании в культуре клеток 5мМ глюкозы; Г – количество протеогликанов при глюкозе концентрации 25мМ). Сафранин О имеет свойство связываться с протеогликанами, образуя химическое соединение с ярко-красной окраской

Заключение

В результате проведенных исследований можно сделать следующие выводы:

• 1.    Было показано, что повышение концентрации глюкозы в питательной среде оказывает положительное влияние на жизнеспособность хондроцитов, а также на их синтез протеогликанов.

• 2.    Установлено, что при концентрации глюкозы 25 мМ происходит увеличение количества мертвых хондроцитов, при этом не снижается синтез протеогликанов.

• 3.    Выявлена положительная зависимость между концентрацией глюкозы и размером клеток, что может быть связано с гипертрофией хондроцитов.