Влияние хлорида кадмия на жирнокислотный состав высших водных растений реки Ангара

Проведён сравнительный анализ содержания жирных кислот в тканях Myriophyllum spicatum L. и Elodea canadensis Michx. в условиях воздействия 0,05 М раствора хлорида кадмия в течение 24 часов. Показаны изменения в составе жирных кислот в ответ на воздействие токсиканта. Выявлены отличия в динамике изменения содержания жирных кислот под воздействием хлорида кадмия у исследованных видов.

Кадмий относится к группе тяжёлых металлов, обладает значительной токсичностью, подвижностью, проницаемостью и способностью к накоплению в тканях живых организмов. Поступает в водоёмы со стоками предприятий горнодобывающей, обогатительной и электролизной промышленности, а также с сельскохозяйственных полей при использовании удобрений. Особенно значительное влияние кадмий оказывает на организмы, обитающие в водоёмах с низкой минерализацией или пониженными значениями рН (Квеситадзе, 2005; Кузнецова и др., 2008; Моисеенко, 2009).

Неудовлетворительное качество воды является причиной почти 80% всех заболеваний в мире. Состав природных вод формируется под влиянием абиотических факторов и биоты водоёмов. В последнее время всё большее влияние на состав воды многих водоёмов оказывают антропогенные факторы (Раткович, 2003; Фаинс и др., 2007; Бреховских и др., 2008).

Высшие водные растения являются первопродуцентами в водных экосистемах, принимают участие в обмене биогенных элементов, самоочищении воды, способны накапливать и трансформировать поллютанты. Они используются при биоиндикации и биотестировании состояния водоёмов. Однако недостаточность сведений по экологии и физиологии большинства видов макрофитов ограничивает возможности для их использования в качестве индикаторных видов (Садчиков, Кудряшов, 2005; Бреховских и др., 2008; Кокин, 1982; Егоркина, 2000; Мелихова и др., 2008).

В водоёмах байкальского региона сосредоточены значительные запасы пресных вод, только в озере Байкал содержится до 20% её мировых запасов. Сток воды из озера осуществляется только через реку Ангара. Флора и фауна озера Байкал, его водосборного бассейна и реки Ангара содержит в себе значительное разнообразие эндемичных таксонов, а также ряд широко распространённых видов. Гидрохимические и гидрофизические условия характеризуются высоким содержанием кислорода, низкой минерализацией и температурой (Тимошкин и др., 2001; Ижболдина, 2007; Тахтеев и др., 2009). При разработке методов биологической оценки состояния водоёмов байкальского региона, стоит учитывать специфику их биотических и абиотических особенностей.

Под воздействием факторов окружающей среды происходят изменения в липидном и жирнокислотном составе мембран растений. Метаболизм липидов тесно связан с дыханием, фотосинтезом, стрессовой реакцией и другими физиологическими процессами. Сравнительное изучение липидного и жирнокислотного состава гидробионтов позволяют выявить нарушения ещё до проявления морфологических и популяционных изменений (Чиркова, 1997; Розенцвет и др., 1999; Верещагин, 2005; Ипатова, 2005).

Целью исследования было изучить и сравнить относительный состав жирных кислот общих липидов наиболее массовых видов высших водных растений реки Ангара при воздействии хлорида кадмия.

Материалы и Методы:

Макрофиты: Elodea canadensis Michx. и M yriophyllum spicatum L. собирались в верхнем течении реки Ангара на левом берегу стандартными методами гидроботаники в июле – сентябре 2009 г., средняя температура воды при вылове составляла 10–12ºС. После вылова растения промывались проточной водой для избавления от эпифитов, разделялись по видам и содержались 14–30 дней в аквариумах при постоянной аэрации и замене ½ объёма воды каждые 2–4 дня. Воду для содержания растений брали из реки Ангара. Температура содержания в лабораторных условиях составляла 19–20ºС, фотопериод 16 ч. Источником света служили флуоресцентные фито-лампы Sylvania F18W/GRO (Германия) с максимумами выделения в красной и синей областях спектра (отношение интенсивности излучения красного света к интенсивности излучения синего 1,42). Интенсивность освещения 1000 лк.

Оба вида относятся к цветковым – Magnoliophyta. Elodea canadensis многолетнее, погружённое в воду, слабоукореняющееся, двудомное растение семейства Водокрасовых, класса Liliopsida. В Евразию занесены только женские растения. Myriophyllum spicatum – многолетнее корневищное растение с прямыми, ветвистыми, погружёнными в воду стеблями, относится к семейству Сланоягодниковые, классу Magnoliopsida (Азовский, Чепинога, 2007).

После культивирования растения экспериментальной группы помещали в 0,05 М раствор хлорида кадмия на 24 ч. Для анализа отбиралась усреднённая проба биомассы, состоящая из нескольких побегов целиком (стебель с листьями) весом 1 г. Растения промывались щеточками с мягким ворсом в проточной воде, для избавления от эпифитов. Навеску растительного материала фиксировали жидким азотом и растирали в фарфоровой ступке до получения гомогенной массы. Липиды экстрагировали смесью хлороформ:метанол (2:1) (Bligh, Dyer, 1959). Хлороформ из липидного экстракта удаляли под вакуумом с помощью роторного испарителя ИР-1ЛТ, Labtex (Россия). Для получения метиловых эфиров жирных кислот к экстракту суммарных липидов после удаления растворителя добавляли 5% метанольный раствор Н 2 SO 4 и нагревали на водяной бане при 60°С в течение 30 минут. Метиловые эфиры жирных кислот, после охлаждения, трижды экстрагировались гексаном (Christie, 1993). Дополнительную очистку метиловых эфиров жирных кислот проводили методом ТСХ на алюминиевых пластинках с силикагелем Sorbfil ПТСХ-АФ-В (Россия) в камере с бензолом. Анализ метиловых эфиров жирных кислот проводили методом газожидкостной хроматографии с использованием хромато-масс-спектрометра 5973N/6890N MSD/DS Agilent Technologies

(США). Детектор – масс-спектрометра – квадруполь, способ ионизации электронный удар (EI), энергия ионизации 70 эВ, для анализа использовали режим регистрации полного ионного тока. Для разделения использовали капиллярную колонку HP-INNOWAX, (30м × 250 мкм × 0,50 мкм). Неподвижная фаза – полиэтиленгликоль. Подвижная фаза: гелий, скорость потока газа 1 мл/мин. Температура испарителя 250ºС, источника ионов 230ºС, детектора 150ºС, температура линии, соединяющей хроматограф с масс-спектрометром, 280ºС. Диапазон сканирования 41-450 а.е.м. Объем вводимой пробы – 1 мкл, разделение потоков 5:1. Хроматографирование выполняли в изократическом режиме при 200ºС. Идентификацию метиловых эфиров жирных кислот проводили с помощью расчета эквивалентной длины алифатической цепи (ECL). Кроме этого использовали библиотеки масс-спектров NIST 05, Christie, а также сравнение времени удерживания со временами удерживания стандартных соединений. Относительное содержание жирных кислот определяли в весовых процентах от общего их содержания в исследуемом образце. Для оценки степени ненасыщенности жирных кислот рассчитывали индекс двойной связи (ИДС), как сумму произведений весовых процентов каждой ненасыщеной кислоты на число двойных связей в её молекуле, делённую на 100, согласно методу, предложенному Lyons с соавт. (Lyons et al., 1964).

Достоверность различий оценивали с помощью Т -критерия Манна-Уитни (Гланц, 1998).

Результаты :

Как видно из таблицы у исследованных видов на кислоты с длиной цепи 16 и 18 атомов углерода приходилось более 95%. Данная особенность не является уникальной и характерна для многих систематических групп живых организмов, в том числе и для высших растений, так как преимущественно 16-ти и 18-ти углеродные жирные кислоты образуют основу клеточных мембран (Гудвин, Мерсер, 1986; Gunstone, 1996; Napolitano, 1998). У исследованных видов в составе липидов содержится меньше насыщенных жирных кислот, чем ненасыщенных.

Экспозиция исследованных видов в 0,05 М растворе хлорида кадмия в течение 24-х ч приводила к изменению в составе жирных кислот их тканей. Соотношение суммарных долей ненасыщенных и насыщенных жирных кислот менялось под воздействием хлорида кадмия. Насыщенных кислот становилось больше, их суммарное содержание увеличилось с 20% до 21% у M.spicatum и с 25% до 29% у E. canadensis .

Под воздействием хлорида кадмия происходило увеличение содержания всех насыщенных жирных кислот у M.spicatum, кроме гептадекановой кислоты (С17:0), чьё содержание, напротив, снижалось и арахиновой кислоты (С20:0), её доля не изменялась. Однако у M. spicatum достоверное увеличение содержания, по сравнению с контролем, выявлено только для миристиновой (С14:0) и пентадекановой (С15:0) кислот. Ненасыщенных жирных кислот у данного вида становилось больше, исключение составили линолевая (С18:2ω6) и гондоиновая (C20:1ω9) кислоты, тем не менее, статистически достоверных изменений в содержании ненасыщенных жирных кислот не выявлено. Перераспределение относительного содержания насыщенных, моно- и полиненасыщенных жирных кислот у M. spicatum не сказывалось на значении индекса двойной связи.

Относительное содержание жирных кислот E. canadensis менялось иным образом, чем у M. spicatum . Увеличивалось содержание всех кислот, кроме α-линоленовой (С18:3ω3), но достоверно только пентадекановой (С15:0), стеариновой (С18:0) и арахиновой (С20:0). Содержание же α-линоленовой кислоты (С18:3ω3) достоверно снижалось по сравнению с контролем. Изменения массовых долей жирных кислот E. canadensis приводило к снижению индекса двойной связи, однако данное изменение не носило статистически достоверного характера.

Таким образом, можно констатировать, что под воздействием 0,05 М хлорида кадмия в течение 24 ч состав жирных кислот меняется у исследованных видов по-разному. Менее выражены эти изменения у M. spicatum , по сравнению с E. canadensis . В целом, состав жирных кислот M. spicatum оказался более стабильным к воздействию токсиканта.

Обсуждение :

Известно, что кадмий является токсичным, накапливаясь в тканях организмов, не подвергается биодеградации и практически не выводится из организма. Показано, что тяжёлые металлы, в том числе кадмий снижают рост растений, негативно сказываются на их развитии, нарушают процессы транспорта ассимилятов и минерального питания, влияют на водный и гормональный обмен, снижают активность фотосинтеза и дыхания (Кузнецова и др., 2008; Гармаш, Головко, 2009; Колесниченко, 2009). Вероятно, выявленные изменения состава жирных кислот у исследованных видов связаны с воздействием кадмия на процессы жизнедеятельности и метаболизм липидов в частности.

Таблица. Состав (% весовой) жирных кислот общих липидов высших водных растений в контроле и после воздействия 0,05М CdCl2

	M.spicatum	M.spicatum	α	E.canadensis	E.canadensis	α
	кон.	24 ч CdCl 2		кон.	24 ч CdCl 2
С14:0	0,34±0,04	0,56±0,14	0,032	0,54±0,24	0,62±0,14	нет
С15:0	0,08±0,02	0,18±0,05	0,016	0,14±0,04	0,32±0,11	0,032
С16:0	17,30±1,93	18,17±2,72	нет	20,00±1,89	22,15±2,92	нет
С17:0	0,27±0,11	0,18±0,03	нет	0,56±0,09	0,78±0,21	нет
С18:0	1,23±0,60	1,54±0,56	нет	2,66±0,67	4,06±0,76	0,032
С20:0	0,14±0,07	0,14±0,07	нет	0,33±0,11	0,48±0,11	0,063
С21:0	-	-	нет	0,14±0,021	0,15±0,04	нет
С22:0	0,21±0,081	0,22±0,052	нет	0,37±0,16	0,50±0,21	нет
∑ С16:1*	0,71±0,14	0,83±0,19	нет	1,65±0,73	1,75±0,64	нет
∑ С18:1**	2,75±0,81	2,99±1,41	нет	1,90±0,69	2,40±0,85	нет
С18:2ω6	28,02±4,36	23,94±1,20	нет	18,04±3,09	18,99±0,94	нет
С18:3ω3	47,84±7,61	50,65±6,02	нет	53,51±4,08	47,35±4,96	0,063
C20:1ω9	0,22±0,091	0,15±0,07	нет	0,06±0,012	0,07±0,013	нет
ИДС	2,03±0,14	2,04±0,15	нет	2,00±0,10	1,84±0,14	нет

Приведено среднее значение ± стандартное отклонение, n = 5 для контрольной выборки и n = 4 для экспериментальной; ^«1» – n = 4; ^«2» – n = 3;^«3» – n = 2; * – сумма изомеров пальмитолеиновой кислоты; ** -сумма олеиновой и цис- вакценовой кислот; α – уровень значимости при сравнении экспериментальной выборки с контрольной; «нет» – статистически достоверных отличий не выявлено, «-» кислота не обнаружена.

Одним из механизмов токсического действия тяжелых металлов и, в частности, кадмия является его соединение с SH-группами белков и инициация перекисного и свободнорадикального окисления. Под воздействием тяжёлых металлов нарушаются функции мембран, показателем их трансформации служат изменения в составе жирных кислот. Жирные кислоты, будучи составным компонентом мембранных липидов, влияют на физико-химические свойства мембран, от которых, в свою очередь, зависят многие физиологические процессы. Выполняя свои барьерные функции, мембраны представляют собой первичную мишень и являются первым рубежом на пути загрязняющих веществ. В ряде работ предлагается считать изменения состава жирных кислот липидов неспецифической реакцией.

Неспецифичность проявляется в увеличении ненасыщенности в ответ на воздействие разных стрессоров. Однако показано, что под воздействием тяжелых металлов увеличивается количество насыщенных жирных кислот, что делает упаковку мембранных липидов более плотной и тем самым стабилизирует мембраны и уменьшает их проницаемость (Чиркова, 1997; Холодова и др., 2005; Кузнецова и др., 2008; Колесниченко, 2009; Нестеров и др., 2009; Ху и др., 2009). Изменения жирнокислотного состава у исследованных видов под воздействием хлорида кадмия были выражены в разной степени. Можно предположить, что действие токсиканта на метаболизм липидов каждого вида имеет свои особенности. Мембраны E. canadensis, вероятно, подвергаются более глубоким модификациям, так как у данного вида происходит достоверное снижение содержания линоленовой кислоты (С18:3ω3). Снижение доли этой кислоты, возможно, может быть обусловлено активацией перекисного окисления липидов, снижением активности дыхания или совместным влиянием обоих факторов. У данного вида, также достоверно увеличивается содержание пентадекановой (С15:0), стеариновой (С18:0) и арахиновой (С20:0) кислот. Жирнокислотный состав M. spicatum остаётся более стабильным, и, вероятно, метаболизм липидов в меньшей степени подвержен влиянию хлорида кадмия. Известно, что данный вид рекомендован для фиторемедиации от загрязнения тяжёлыми металлами, в том числе кадмием (Квеситадзе и др., 2005). Таким образом, нами установлено, что у исследованных растений изменение состава жирных кислот в ответ на токсическое воздействие 0,05 М хлорида кадмия является видоспецифическим. В связи с этим, выявленные биохимические отличия стоит учитывать при разработке методов оценки качества и очистки загрязнённой воды.