Влияние холодового стресса на морфофункциональные показатели тимуса в эксперименте

Гармаева Д.К., Белолюбская Д.С., Федорова А.И., Аржакова Л.И., Афанасьева О.Г. Влияние холодового стресса на морфофункциональные показатели тимуса в эксперименте// Морфологические ведомости.- 2019.- Том 27.- № 2.- С. 19-23. (27).02.19-23

Garmaeva DK, Belolyubskaya DS, Fyodorova AI, Arzhakova LI, Afanasieva OG. The effect of the cold stress on morphological and functional parameters of the thymus in the experiment. Morfologicheskie Vedomosti – Morphological Newsletter. 2019 August 5;27(2):19-23. (27).02.19-23

Введение . Несмотря на успехи человечества в создании технических средств защиты от неблагоприятных факторов внешней среды, человек по-прежнему уязвим перед суровым могуществом Арктики. Для Якутии экстра-континентальный климат на фоне постоянно действующего охлаждающего экрана с поверхности земли является главным внешним фактором, отрицательно влияющим на здоровье северянина. Задачи сегодняшнего дня - найти способы сохранения здоровья работников Арктического региона современными средствами медико-биологической науки. Иммунная система представляет собой уникальный, природный защитный механизм. Благодаря слаженности работы всей функциональной системы иммунитета организм способен противостоять множеству факторов, оказывающих негативное влияние. Уникальность иммунной системы состоит в том, что в ней заложены такие регуляторные функции, которые позволяют при наличии каждого конкретного антигена, являющегося пусковым моментом, приводить огромную машину под названием иммунная система в действие и реагировать специфическим иммунным ответом в соответствии с его индивидуальными особенностями [1-2]. От состояния иммунной системы, ее адаптационных возможностей зависит адекватность реагирования организма на генетически чужеродные агенты и вероятность развития аллергических, инфекционных, аутоиммунных и онкологических заболеваний [3]. Вместе с тем, в экстремальных условиях защитные механизмы и адаптивная перестройка организма могут давать срыв - дезадаптацию, вызывая целый ряд патологических явлений [4-5]. К наиболее распространённым стрессовым факторам относится холод, который оказывает угнетающее действие на выраженность клеточного и гуморального иммунного ответа [6-10]. Вместе с тем, в морфологических изменениях в центральном органе иммуногенеза - тимусе при хроническом стрессе остается немало нерешенных вопросов, что определяет актуальность выбранного исследования.

Цель исследования - изучить влияние экспериментального холодового стресса на морфофункциональные показатели тимуса крыс в разные сутки с помощью морфометрического анализа.

Материалы и методы исследования . В работе использованы белые беспородные половозрелые крысы самцы массой тела 200-300 г (n=40). Животные были разделены на 5 групп по 8 крыс в каждой: 1-я - интактные животные, содержавшиеся в обычных условиях вивария, 2-5 группы - животные, подвергнутые воздействию холода. Холодовое воздействие на животных производили путем помещения их в индивидуальных клетках в холодильную камеру «Vestfrost» (Дания) при температуре –10±20С по 1 часу в одно и то же время суток в течение 7, 14, 21 и 30 дней. Эксперимент проводился в условиях одного вивария, животные содержались в условиях ad libitum. Выведение животных из опыта проводили с помощью эфирного наркоза на 7, 14, 21 и 30 сутки. Протокол экспериментальной части исследования на этапах содержания животных, моделирования патологических процессов и выведения их из опыта, соответствовал принципам биологической этики, изложенным в Международных рекомендациях по проведению медико-биологических исследований с использованием животных (1985), Европейской конвенции о защите позвоночных животных, используемых для экспериментов или в иных научных целях (Страсбург, 1986), приказе МЗ СССР № 755 от 12.08.1977 «О мерах по дальнейшему совершенствованию организационных форм работы с использованием экспериментальных животных», Приказе МЗ РФ № 267 от 19.06.2003 «Об утверждении правил лабораторной практики». Все эксперименты проводили с соблюдением требований согласно Приложению № 4 «О порядке проведения эвтаназии животного» к Правилам проведения работ с использованием экспериментальных животных (приложение к Приказу МЗ СССР № 755 от 12.08.1977).

Материал фиксировали формалином, последующую заливку в парафин делали стандартным способом. Для морфологического исследования изготавливали серийные срезы толщиной 5 мкм, окрашивали гематокислин-эозином. Морфометрическое исследование проведено при помощи программы ImageJ в 25 полях зрения площадью 2500 мкм2 на 5 срезах центральных частей долек тимуса с использованием масляной иммерсии при увеличении окуляра х10 и объектива х100. Подсчет абсолютного числа клеток в определенном числе полей зрения производили в субкапсулярной, центральной корковой, корково-медуллярной и центральной мозговой зонах тимуса. Относительные площади коркового и мозгового вещества определяли методом точечного подсчета. В связи с тем, что результаты исследования фактически выражались в показателях числа клеток в единице площади (полей зрения) препарата, имеющих по своей природе относительный характер, статистический анализ проводили путем попарного сравнения показателей в разных группах. Достоверность различий определялась по критерию Стьюдента, различия считали достоверными при р<0,05.

Результаты исследования и обсуждение. При гистологическом исследовании препаратов тимуса интактных животных выявлено типичное дольчатое строение, четко различимое корковое (57,0±3,87) и мозговое (33,2±1,92) вещество. Корково-мозговой индекс равен 1,7±0,12. Площадь коркового вещества более темная за счет большей плотности расположения множества незрелых лимфоцитов и более обширная, чем площадь мозгового вещества. В субкапсулярной области располагаются изолирующие снаружи корковое вещество эпителиоретикулярные клетки, образующие плотный слой. Ядра этих клеток имеют уплощенную или треугольную форму. Субкапсулярная зона коркового вещества содержит лимфоциты более крупных размеров с округлыми ядрами, представляющими собой митотически активные лимфобласты. В более глубоких отделах коркового вещества отмечается постепенное преобладание преимущественно малых и средних лимфоцитов, реже встречаются фигуры митоза. Эпителиоретикулоциты располагаются поодиночке, имеют крупное ядро, овальной или угловатой формы и чаще всего с одним ядрышком. Цитоплазма бледная, плохо различимая из-за большого количества лимфоцитов. В области перехода коркового вещества в мозговое отмечается большое количество сосудов, клеточный состав включает разные по степени зрелости лимфоциты, стромальные клетки, макрофаги, плазмоциты. В мозговом веществе вследствие меньшего количества лимфоцитов эпителиоретикулярные клетки обнаруживаются лучше, имеют ядра неправильной формы с несколькими ядрышками. Среди лимфоцитов преобладают средние и крупные, более светло окрашенные, чаще встречаются зрелые клетки. Обнаруживаются также макрофаги, плазмоциты и тельца Гассаля.

Тельца Гассаля немногочисленные, образованные концентрически наслаивающимися эпителиоретикулоцитами с характерным строением. Результаты согласуются с данными других авторов [1,11-12].

Известно, что холод относится к стрессовым факторам и оказывает влияние на различные системы организма, в частности, иммунную систему. Тимус и другие лимфоидные органы очень быстро реагируют на стрессорное повреждение [13]. Морфометрическое изучение тимусов экспериментальных животных, подвергнутых ежедневному воздействию холода, выявило достоверные изменения во всех исследуемых группах.

Таблица 1

Клеточный состав морфофункциональных зон тимуса крыс, подвергнутых экспериментальному воздействию (абсолютное число клеток в соответствующих полях зрения, М±m)

Примечание: различия статистически достоверны (p<0,05): *- по сравнению с 1 группой; **- со 2-й группой; ***- с 3-й группой;

****- с 4-й группой.

Во 2-й группе после недельного воздействия холода показатели относительных площадей коркового и мозгового вещества составляют 48,0±3,53 и 37,4±2,41 соответственно, корково-мозговой индекс достоверно снизился до 1,28±0,15. Анализ клеточного состава показал незначительное снижение количества лимфоцитов преимущественно в области коркового вещества, однако достоверные отличия отмечались только в увеличении количества эпителиоретикулярных клеток в субкапсулярной зоне.

В 3-й группе, спустя две недели воздействия, показатели площадей коркового (56,0±3,16) и мозгового вещества (36,4±4,04), корково-мозговой индекс (1,55±0,23) не отличаются от показателей интактного контроля. Морфометрический подсчет клеточных элементов показал увеличение показателей количества лимфоцитов, достоверное в субкапсулярной зоне. Наблюдается дальнейший рост количества эпителиоретикулоцитов, а также макрофагов, число которых достоверно изменилось во всех зонах тимуса. В центральной зоне коры и кортико-медуллярной зоне отмечается увеличение клеток с фигурами митоза, свидетельствующее об их активной пролиферации.

Спустя три недели эксперимента в 4-й группе данные относительных площадей коркового и мозгового вещества составили 40,2±4,76 и 48,6±8,53, корково-мозговой индекс (0,85±0,24) демонстрирует значительное снижение показателя по сравнению со всеми первыми группами (в 2 раза, в 1,5 раза и 1,8 раза соответственно). Подсчет клеточных элементов в этот период показал выраженные изменения, отмечаемые во всех морфофункциональных зонах тимуса. В субкапсулярной зоне отмечается резкое снижение количества делящихся лимфоцитов в 2,1 раза по сравнению с интактным контролем, в 1,6 раза по сравнению со 2-й группой и в 1,8 раза по сравнению с 3-й. Количество эпителиоретикулярных клеток также значительно увеличено относительно нормы. В центральной зоне коркового вещества и кортико-медуллярной зонах наибольшие изменения отмечаются по сравнению в 3-й группой и включают возвращение показателей делящихся клеток к цифрам близким к норме и менее выраженное повышение числа макрофагов. Отмечается частое выявление апоптозных телец и тучных клеток. В мозговом веществе отмечается рост количества эпителиоретикулоцитов по сравнению с 2-й и 3-й группами.

В 5-й группе после одномесячного срока воздействия показатели площадей коркового (43,4±4,51), мозгового вещества (50,0±5,34) и корково-мозгового индекса (0,88±0,18) остаются на том же уровне, что и в 4-й группе. По показателю корково-мозгового индекса наблюдается снижение в 1,9 раза, в 1,4 раза и 1,7 раза по сравнению с 1-3 группами. Данные анализа клеточного состава тимусов отражают наиболее выраженные изменения среди эпителиоретикулярных клеток. Наблюдается достоверное снижение их числа в субкапсулярной зоне по сравнению с 3-й и 4-й группами, значительное снижение в корковом веществе и кортико-медуллярной зоне по сравнению со всеми группами, и существенный рост их количества в мозговом веществе. Тельца Гассаля характеризуются выраженными дегенеративными изменениями в эпителиоретикулоцитах с продуктами распада клеток. В субкапсулярной зоне сохраняется сниженное количество клеток с фигурами митоза, тогда как в других зонах данные не отличаются от показателей контроля.

Сходные изменения в структурно-функциональных зонах тимуса крыс при экспериментальном охлаждении отмечены в работах других авторов на 10-12 сутки эксперимента^, 14-19]. Также в экспериментах авторов [5,11-12, 20-22] в которых изучалось влияние иных стрессовых факторов на тимус. По нашим данным, структурные преобразования в тимусе, в виде выраженной акцидентальной инволюции тимуса в стадии гипотрофии, основными проявлениями которой являются уменьшение массы и объема органа, уменьшение размеров коркового вещества, угнетение лимфопоэтической функции и усиление гибели лимфоцитов по типу апоптоза, приводящие в конечном итоге к снижению численности лимфоидной популяции в тимусе, выявлены при экспериментальном охлаждении после одномесячного срока.

Заключение . Полученные данные свидетельствуют о воздействии холодового фактора на состояние и функционирование тимуса. Морфофункциональные данные 14-х суток эксперимента показал, что показатели площадей коркового и мозгового вещества, корково-мозговой индекс не отличаются от показателей интактного контроля. Отмечается увеличение показателей количества лимфоцитов, достоверное в субкапсулярной зоне, рост количества эпителиоретикулоцитов, а также макрофагов. В центральной зоне коры и кортико-медуллярной зоне отмечается увеличение клеток с фигурами митоза, свидетельствующее об их активной пролиферации. Эти данные могут указывать на развитие компенсаторно-приспособительных изменений в тимусе на холодовое воздействие на 14-е сутки. На 21, 30 сутки объем коркового вещества в группе с экспериментальным холодовым воздействием был достоверно меньше, объем мозгового вещества больше по сравнению с интактной группой. Происходит перераспределение объема различных структурнофункциональных зон, свидетельствующие о снижении функциональной активности тимуса. Усиление гибели лимфоцитов по типу апоптоза, снижение митотической активности и накопление макрофагов. Таким образом, после незначительного угнетения функциональной активности тимуса на 7 сутки эксперимента, на 14 сутки холодового стресса в центральном органе иммуногенеза отмечается развитие компенсаторно-приспособительных изменений, в то время как, длительное стрессовое холодовое воздействие (30 суток) приводит к структурно-функциональным изменениям тимуса в виде развивающейся акцидентальной инволюции, которая проявляется в виде уменьшения размеров коркового вещества, угнетение лимфоцитопоэтической функции и усиление апоптоза, приводящее к снижению численности лимфоидной популяции в тимусе.