Влияние холодового закаливания на теплоустойчивость проростков пшеницы

Среди большого числа работ по устойчивости растений очень мало касаются совместного влияния двух или более стресс-факторов, хотя реакции растений на самостоятельное или совместное (последовательное или одновременное) воздействие стрессоров могут количественно и даже качественно различаться. Явление, когда действие одного неблагоприятного фактора может приводить к повышению устойчивости к другим факторам, названо «кросс-адаптацией». Оно известно довольно давно, однако до сих пор его молекулярно-биохимические механизмы остаются до конца не выясненными.

Анализ литературы, посвященной защитным реакциям растений при совместном или последовательном действии нескольких факторов, демонстрирует их многообразие, особенно вовлечение в них низкомолекулярных метаболитов, в том числе пролина, полиаминов, веществ фенольной природы, а также каротиноидов. Вклад каждого из этих метаболитов в защитный ответ неравнозначен и, возможно, приурочен к различным стадиям адаптационного процесса или является видоспецифичным [Чиркова, 2002, Титов, Таланова, 2009].

В настоящее время довольно хорошо изучена физиология и биохимия теплового шока, который рассматривается как неспецифический стрессорный фактор, способный модифицировать метаболизм любого живого организма. Последствия будут зависеть от режима гипертермии, генетических особенностей организма и стадии онтогенеза [Раздельное ..., 1993; Кузнецов, Дмитриева, 2005; Чудинова, Суворов, 2011].

До сих пор остается неизвестной природа рецептора, с помощью которого растительная клетка вос- принимает температурный сигнал. Предполагают, что при изменении вязкости мембран может происходить открывание кальциевых каналов [Карпец, Колупаев, 2009] и активация кальций-зависимых путей трансдукции сигнала в геном [Трунова, 2007].

Имеются сведения о том, что холодовое закаливание наряду с повышением холодоустойчивости повышает и теплоустойчивость ряда видов растений [Балагурова, Акимова, Титов, 2001; Трунова, 2007; Титов, Таланова, 2009]. Авторы делают предположение, что гипотермия индуцирует запуск защитных систем, обеспечивающий повышение жароустойчивости растений.

В начальный период (первые двое суток) закаливающая низкая температура (2°С) вызывала рост устойчивости к хлориду натрия и к ионам свинца. Однако в дальнейшем с увеличением продолжительности холодового воздействия характер изменения этих видов устойчивости различался [Титов, Таланова, 2009].

Молекулярные системы устойчивости растений к одновременному действию пониженной и высокой температуры исследованы недостаточно.

В связи с этим целью нашей работы было выяснение влияния предварительной гипотермии на содержание углеводов и пролина в проростках пшеницы при последующем действии на них высокой температуры на этапах стресс-реакции и специализированной адаптации.

Объекты и методы исследования

Проростки пшеницы (Тriticum аestivum L.) в течение недели выращивали в климатической камере ШН-М на вермикулите при температуре 22°С,

влажности 75–80% и освещенности люминесцентными лампами 15 ч. в сутки (1-й вариант – контроль). Затем часть проростков подвергали температурным воздействиям по следующей схеме: 2-й вариант – 4°С (6 ч.) (неповреждающая гипотермия); 3-й вариант – 45°С (4 ч.) (повреждающая гипертермия); 4-й вариант – холодовое закаливание (4°С, 6 ч.) и сразу гипертермия (45°С, 4 ч.).

Все температурные обработки проводили в первой половине дня.

Для анализа брали растения через 12 ч. (стадия стресс-реакции адаптации) и 72 ч. (стадия адаптации) после окончания всех обработок.

Анализировали прирост проростков за трое суток, первичную теплоустойчивость по методу Ф.Ф. Мацкова [Физиология устойчивости …, 1991]. В побегах, высушенных до воздушно-сухого состояния, определяли содержание глюкозы фотометрическим методом Вознесенского [Большой практикум …, 2012], количество крахмала – фотометрическим методом [Большой практикум …, 2012], содержание пролина – по методу L.S. Bates, R.P. Waidren, J.D. Tear [1973].

Повторность биохимических анализов – 2–3-кратная. Результаты обрабатывали статистически с использованием однофакторного дисперсионного анализа. Определяли достоверность различий между некоторыми вариантами по наименьшей существенной разнице (НСР 0,05).

Результаты и их обсуждение

Известно, что термоустойчивость растений является генетически обусловленным признаком, который варьирует довольно в широких пределах в зависимости от генотипа (вида), интенсивности и продолжительности воздействия [Кузнецов, Дмитриева, 2005; Титов, Таланова, 2009].

Важным показателем устойчивости растений к действию неблагоприятных факторов является изменение их ростовых параметров.

Анализ полученных нами данных показал (рис. 1), что монодействие гипертермии практически полностью ингибировало рост надземной части проростков. Воздействие гипотермии в меньшей степени изменило динамику прироста проростков. Однако варианты с последовательным влиянием этих факторов имели меньшее снижение прироста, чем при монодействии гипертермии.

Известно, что прекращение роста является необходимым условием прохождения фазы адаптации к стрессору. Метаболические изменения, происходящие в это время, могут быть вызваны изменением гормонального и энергетического баланса [Колесниченко, Войников, 2003].

Результаты, представленные в таблице, показали, что первичная теплоустойчивость при холодовом закаливании повышается до уровня контроля.

Возможно, что холодовое воздействие вызыва- ет появление в клетках соединений, которые являются результатом определенных (обратимых) нарушений и одновременно выполняют функции сигнала, запускающего механизмы формирования повышенной резистентности. В отсутствие такого сигнала адаптивный потенциал растений, очевидно, проявляется не в полной степени.

Рис. 1 . Динамика прироста побегов при раздельном и последовательном действии гипо- и гипертермии за 3 сут.

В последние годы общепризнанной становится точка зрения, согласно которой в основе большинства адаптивных преобразований, происходящих в клетках растений под влиянием низкой закаливающей температуры как на уровне ферментативных процессов, так и на уровне структурных изменений, лежит синтез ряда стрессовых белков: белков холодового шока (БХШ), COR- LTI-, KIN-а также LEA-белков [Колесниченко, Войников, 2003; Трунова, 2007].

Динамика первичной теплоустойчивости проростков пшеницы при закаливании и гипертермии

Вариант	Степень повреждения листьев при t ° C
	40	50	60
Контроль	-	+	+++
Гипотермия	-	++	+++
Гипертермия	-	++	+++
Гипотермия+ гипертермия	-	+	+++

Примечание: «-» отсутствие побурения; «+» - побурение менее 50% ; «++» - побурение на площади около 50%-; «+++» - сплошное побурение.

Следовательно, уже в начальный период холодового закаливания в растениях начинаются адаптивные преобразования, часть из которых носит неспецифический характер, что, очевидно, и вызывает дополнительное повышение устойчивости при последующем действии на растения высокой температуры. Все это указывает на развитие перекрестной адаптации. Механизм подобного протекторного действия изучается.

Одной из универсальных защитных реакций растений в ответ на действие абиотических факторов, нарушающих водный статус (низкие положительные температуры, засуха, засоление и других), является аккумуляция совместимых осмолитов (нетоксичных и не вызывающих изменений в метаболизме веществ), обладающих осморегуляторным и стресс-протекторным эффектом [Шакирова, 2001; Чиркова, 2002], прежде всего, растворимых сахаров и свободного пролина (Титов, Таланова, 2009).

Сложилось мнение, что свободный пролин при стрессе обладает полифункциональным биологическим эффектом – осмопротектор, стабилизатор макромолекул и мембран, дополнительный источник энергии и азота, антиоксидант и др. [Кузнецов, Шевякова, 1999].

Однако его роль в повышении устойчивости растений остается не вполне ясной. Например, не-солеустойчивый сорт пшеницы накапливал пролина больше, чем солеустойчивый [Кафи, Стюарт, Борланд, 2003]. Не выяснен также механизм регуляции накопления пролина при стрессе.

Полученные нами результаты (рис. 2) показали достоверно повышенное содержание пролина во всех опытных вариантах на этапе стресс-реакции. На этапе адаптации количество пролина в 3 (гипертермия) и 4 (последовательно гипо- и гипертермия) вариантах снизилось до уровня контроля.

Рис. 2 . Изменение содержания пролина в проростках пшеницы при раздельном и последовательном действии гипо- и гипертермии

Анализируя возможный механизм быстрого накопления пролина на стадии стресс-реакции, логично предположить, что в основе его лежит усиление протеолиза в результате освобождения протеаз от белка-ингибитора под действием стрессора.

При этом увеличение активности протеаз, которое происходит в ответ на действие на растения разных стрессоров, можно рассматривать как одну из защитных реакций, направленных на накопление низкомолекулярных протекторов (НМП).

В условиях стресс-реакции аккумуляция пролина, прежде всего, направлена на поддержание в клетках водного гомеостаза. Кроме этого, пролин может оказывать и протекторный эффект, в основе которого лежат гидрофильные и гидрофобные взаимодействия пролина с водной фазой и макромолекулами цитоплазмы, мембран и клеточных органелл, стабилизирующих их конформацию [Кузнецов, Шевякова, 1999].

Мы сравнили углеводный статус проростков пшеницы в условиях раздельного и комбинированного температурного воздействия (рис. 3).

Рис. 3 . Изменение количества глюкозы в проростках пшеницы при раздельном и последовательном действии гипо- и гипертермии

Результаты показали, что уровень глюкозы у всех опытных растений был пониженным по сравнению с контролем.

Особенно существенно количество глюкозы уменьшалось на 3-й день после гипертермического воздействия, т.е. на стадии адаптации.

Это можно объяснить расходованием глюкозы на перехват АФК и на включение альтернативных путей дыхания. Установлено, что сахара перехватывают *ОН-радикал с очень высокой эффективностью и тем самым снижают его токсичность [Влияние сахаров …, 2007].

Известно [Даффус, Даффус, 1987], что избыток накапливающейся при фотосинтезе глюкозы в листьях откладывается в виде крахмала в хлоропластах и амилопластах, иначе глюкоза будет ингибировать фотосинтез. При необходимости, т.е. тогда, когда потребности в энергии выше, чем может дать фотосинтез, этот крахмал гидролизуется до глюкозы α-амилазой (хлоропласты) и β-амилазой (амилопласты).

Анализ соотношения пулов крахмала и глюкозы показал осуществление гидролиза крахмала с образованием глюкозы на стадии адаптации (рис.

• 4) . Можно предположить, что гидролиз крахмала в листьях осуществляется тогда, когда потребности в

  X

  Е

  га Е

  

  на 1 сутки

  вариант на 3 сутки

  Рис. 4 . Изменение соотношения глюкоза/крахмал в проростках пшеницы при раздельном и последовательном действии гипо- и гипертермии

  
  

Некоторое снижение способности растений накапливать глюкозу при гипотермии в определенной мере компенсируется их способностью интенсивно аккумулировать пролин, который, подобно растворимым сахарам, обладает осморегулятор-ным и множественным стресс-протекторным действием. Однако вопрос о степени специфичности сахаров и азотсодержащих НМП малоизучен.

На основании полученных нами результатов и данных литературы можно считать, что в развитии теплоустойчивости растений после предварительной холодовой обработки (кросс-адаптация) активно функционирует многокомпонентная протекторная система, включающая регуляцию пула глюкозы, пролина и других низкомолекулярных соединений. Синтез нескольких НМП имеет важное преимущество, поскольку эти соединения выполняют как общую протекторную функцию, так и высоко специализированную физиологическую роль при адаптации растений к стрессорам различной природы. Это создает возможность их функциональной взаимозаменяемости.

На основании полученных результатов можно сделать следующие основные выводы:

• 1.    Холодовое закаливание (4°С, 6 ч.) проростков пшеницы повышает их теплоустойчивость, что выражается в снижении рост ингибирующего эффекта и уменьшении степени деструкции хлорофилла при последующей гипертермии (45°С, 3 ч.).

• 2.    Установлен различный вклад изучаемых НМП в механизм теплового закаливания. Так, на стадии стресс-реакции основную протекторную

• 3.    Функциональная взаимозаменяемость глюкозы и пролина является эффективным механизмом физиологической адаптации к гипертермии.

роль выполняет пролин, а на стадии адаптации – глюкоза.