Влияние хорионического гонадотропина на продукцию интерлейкина-8 интактными моноцитами. Роль Toll-подобных рецепторов

Хорионический гонадотропин (ХГ) - гликопротеиновый гормон, трофобластный аналог лютеинизирующего гормона (ЛГ), активно участвует в контроле иммунных процессов, сопровояедающих беременность [Magnie et al. 1990; Ширшев, 1998; Ширшев, Куклина, Ярилин, 2003; Ширшев, Куклина, 2005; Ширшев, Заморина, 2011]. Согласно концепции H.F. Acevedo (2002 г.), ХГ не имеет своего «истинного» рецептора, реализуя эффекты через гормональный ЛГ-рецептор за счет высокой степени гомологии с ЛГ. Однако в моноцитах периферической крови небеременных женщин обнаружены лишь следовые количества ДНК ЛГ-рецептора [Kosaka et al., 2002], в то время как ХГ эффективно модулирует функциональную активность моноцитов женщин.

Ранее нами было показано, что ХГ вовлекает в реализацию своих эффектов на уровне моноцитов молекулы Toll-подобных протеинов (TLR4), относящихся к паттерн-распознающим рецепторам (ПРР) [Ширшев, Заморина, 2006]. В основе этого взаимодействия лежит структурное сходство внеклеточных доменов ЛГ-рецептора и TLR4-peuen-тора, основанное на высоком содержании лейцина (так называемые leucin rich repeat (LRR)) [Rosemblit, Ascoli, Segaloff, 1988; Bhowmick et al., 1996]. Молекулы TLR могут распознавать ряд эндогенных продуктов, появление которых не связа но с инфицированием [Tsan, Gao, 2004], и, таким образом, ХГ является эндогенным лигандом для TLR.

Известно, что введение ■ ^субъединицы ХГ (или синтетических олигопептидов, родственных по структуре) в критических состояниях, индуцированных присутствием большого количества бактериальных липополисахаридов (ЛИС), способно останавливать воспалительные реакции [van den Berg et al., 2011]. Вероятнее всего, это происходит в силу способности гормона выступать как конформационный антагонист ЛПС. Таким образом, расшифровка молекулярного механизма действия ХГ, связанного с ПРР на уровне клеток иммунной системы, является фундаментальной задачей, связанной с изучением филогенетически древнего механизма реализации гормон-модулирующей активности.

Неоднозначную роль во время беременности играет интерлейкин-8 (ИЛ-8), являясь цитокином, обеспечивающим ангиогенез и защиту плацентарных оболочек. Вызывая направленную миграцию лейкоцитов в очаг воспаления, он повышает внутриклеточную гибель микроорганизмов, активируя освобождение ими коллагеназы и эластазы, ферментов, расщепляющих внеклеточный матрикс, вырабатываемый цервикальными фибробластами, вовлекается в патологический процесс при преждевременных родах [цит. по: Чистякова и др., 2005]. В 2002 г. показана ХГ-индуцируемая продукция ИЛ-8

моноцитами небеременных женщин, авторы исследования предполагают, что ХГ вовлекает в реализацию своих эффектов маннозные рецепторы, относящиеся к ПРР [Kosaka et al., 2002].

Целью работы являлось изучение роли молекул TLR4 в реализации эффектов ХГ на продукцию ИЛ-8 моноцитами небеременных женщин.

Материалы и методы

Объектами исследования являлись фракционированные моноциты небеременных женщин репродуктивного возраста, находящихся в ранней фолликулярной фазе менструального цикла. Мо-нонуклеарные клетки получали центрифугированием в градиенте плотности фиколл-верографина (1.077 г/см3); полученную суспензию после двойной отмывки средой 199 помещали на чашки Петри с 5% ЭТС и инкубировали 45 мин. при 37 W, затем адгезировавшие моноциты снимали механическим способом, дважды отмывали и стабилизировали инкубированием в течение 45 мин. при 42^ [Pertof et al., 1980]. Полученную суспензию (1x106 мл) инкубировали в полной питательной среде (среда 199 с добавлением 10 шМ HEPES; 2 шМ L-глутамина; 100 мкг/мл гентамицина и 10% ЭТС) с гормоном в течение 2 сут. при 372^ в условиях 5% СО2. Продукцию ИЛ-8 в супернатантах культур моноцитов оценивали иммунофер-ментным методом при помощи коммерческого набора («Вектор-Бест», Россия).

Для изучения влияния ХГ на синтез ИЛ-8, гормон («Profasi», Италия) использовали в концентрации 100 МЕ/мл, что соответствует его пику на 9-11 нед. беременности. [Cole, 2012]. Для изучения взаимодействия гормона с TLR4 использовали также запредельную дозу ХГ 1000 МЕ/мл. Экспрессия CD 14 и TLR4 на клетках оценивалась после инкубации с ХГ (100, 1000 МЕ/мл) при помощи моноклональных антител (TLR4(CD284)/PE; CD14/FITC «eBioscience», Канада) на проточном цитофлуриметре «BD Calibur» (США) в разные сроки инкубации (1, 5, 10, 15 мин.). Для «выключения» Toll-зависимого пути реализации гормонального эффекта применяли немеченые антитела к TLR4 (ab TLR4, «eBioscience», Канада; 0,5 мг/мл, изотипический контроль Mouse IgG2a, k), которые вносили в культуру моноцитов до гормона. Учитывая, что взаимодействие ХГ с «классическим» ЛГ/ХГ рецептором приводит к повышению внутриклеточного уровня циклического аденозинмонофосфата (цАМФ), активирующего про-теинкиназу А (ПКА) [Rao, Zhou, Lei, 2004], в исследовании применяли блокатор ПКА Н-89 («ICN Ph», США) в концентрации 10 мкМ/мл [Parvathenani et al., 1998].

Статистическая обработка данных проводилась с помощью парного t-критерия Стьюдента, для малых групп с помощью п-критерия Манна-Уитни.

Результаты и обсуждение

Ранее нами было показано, что в присутствии высоких доз ХГ снижался уровень СО14+-позитив-ных клеток [Ширшев, Заморина, 2004]. Так как молекула CD 14 функционирует как корецептор TLR4, в данном случае речь идет не о регуляции экспрессии, а о детекции этих молекул. Таким образом, ХГ, взаимодействуя с молекулами TLR4, экранирует их от антител против CD 14.

В настоящем исследовании установлено, что в присутствии ХГ (100, 1000 МЕ/мл) снижался и уровень СВ14+ТЕК4+-позитивных клеток на 1-, 5-и 10-й мин. эксперимента (рис. 1).

□ ХГ 100 МЕ/мл □ ХГ1000 МЕ/мл

Рис. 1. Влияние ХГ на детекцию CD14⁺TLR4⁺-клеток в системе in vitro в динамике (н = 4).

*- достоверные (р < 0.05) по u-критерию Манна-Уитни различия с контролем

Показано, что наиболее активно ХГ (1000 МЕ/мл) взаимодействует с молекулами TLR4 на 5й мин. инкубации (372^), почти вдвое снижая уровень CD14+TLR4+ (рис. 2). Гейтирование пула моноцитов в экспериментах осуществляли по боковому и прямому светорассеянию, а не по CD 14, в силу экранирования CD 14 молекулами ХГ. Таким образом, показано, что ХГ активно связывается с поверхностью моноцитов, взаимодействуя с молекулами TLR4.

Из литературы известно, что меченый FITС ХГ связывается с более чем 80% СО14+-моноцитов, причем процесс связывания дозозависимо блокируется в присутствии нативного XT [Kosaka et al., 2002]. Как уже было отмечено выше, на поверхности моноцитов небеременных женщин не обнаружен ЛГ-рецептор методом проточной цитофлуори-метрии, а клетки содержат лишь следовые количества ДНК ЛГ-рецептора, то есть, существует несоответствие между связыванием гормона на поверхности моноцитов и отсутствием рецептора. Таким образом, нами установлено, что ХГ связывается с альтернативными рецептору структурами на поверхности моноцитов, которые нами идентифицированы как TLR4.

S^S1.'-'.	19,4%
ХГ100 5 мин	) МЕ/мл

^0»       10' ю- 10’       10*

CD14

Рис. 2. Влияние ХГ на детекцию CD 14ТЕВ4-клсток в системе in vitro.

Гистограммы отражают влияние ХГ (1000 МЕ/мл) на количество CD4+TLR4+-KneroK на примере одного эксперимента. В правом верхнем квадранте указан процент СВ14+ТЕК4+-клеток в гейте моноцитов (по FSS/SS). По оси абсцисс - флуоресценция по каналу FL 1, FITC; по оси ординат - по каналу FL2, РЕ

При изучении влияния гормона на продукцию моноцитами ИЛ-8 показано, что ХГ достоверно стимулировал продукцию этого цитокина, что согласуется с исследованиями К. Kosaka с коллегами [2002]. Мы в аналогичных условиях подтвердили также, что стимулирующий эффект ХГ на уровень ИЛ-8 воспроизводился на фоне блокады ИКА. Однако принципиально важным моментом является то, что ИЛ-8-стимулирующий эффект ХГ воспроизводился и на фоне заблокированных антителами TLR4 (рис. 3). Установлено, что в условиях двойной блокады, когда были «выключены» как ИКА, так и TLR4, стимулирующий эффект гормо на полностью отменялся (рис. 3). Таким образом, можно сделать вывод о том, что в зависимости от доступности рецепторов гормон может связываться и «работать» как через ЛГ/ХГ-рецептор, так и через молекулы TLR4, не исключая взаимодействия с маннозными рецепторами.

Рис. 3. Влияние ХГ на продукцию ИЛ-8 моноцитами женщин. Роль TLR4 и ПКА (н =

1 - контроль; 2 - ХГ 100 МЕ/мл; 3 - Н-89; 4 - Н-89 + ХГ 100 МЕ/мл; 5 - контроль изотипа; 6 -AbTLR4; 7-ХГ 100МЕ/мл+аЬТЕК4; 8-ХГ100 МЕ/мл+аЬТЕК4+Н-89;#- достоверные (р<0.05) по t-критерию Стьюдента различия с контролем

В 2002 г. К. Kosaka с коллегами предположили, что ХГ на поверхности моноцитов связывается с маннозными рецепторами (C-lectin). Предварительный контакт моноцитов с D-маннозой ослаблял стимулирующий эффект ХГ в отношении синтеза ИЛ-8, однако блокада ПКА не влияла на реализацию гормонального эффекта. Известно, что ПКА вовлекается в транмиссию гормонального сигнала через ЛГ-рецептор. В то же время, в большинстве моноцитов после стимуляции ХГ, наблюдалась транслокация NF-kB в ядро, несмотря на отсутствие рецептора [Kosaka et al., 2002]. Таким образом, очевидно существование альтернативного пути для ХГ, который мы идентифицировали как ТГК4-путь. Подтверждением этого служит также тот факт, что запуск ТЕК4-пути непосредственно вызывает активацию ядерного фактора NF-kB [Tsan, Gao, 2004].

Необходимо отметить, что сама идея так называемой «альтернативной» рецепции актуальна для ряда гормонов. Так, в 1999 г. D.Z. Simpson с коллегами показал, что питуитарные гормоны, такие как ЛГ и ТТГ, способны взаимодействовать с маннозными рецепторами, которые известны, прежде всего, как лектиновые рецепторы для фагоцитоза. Высказано предположение, что клетки иммунной системы участвуют в клиренсе этих гормонов [Simpson et al., 1999]. Эти рецепторы распознают гликозилированные остатки маннозы, фукозы и GlcNA в Са2+-зависимой манере через карбокси-гидратный распознающий домен [Taylor, 2001]. Известно, что маннозные рецепторы появляются на моноцитах в процессе их дифференцировки в макрофаги, и только что выделенные из периферической крови МПК и культивированные 2 сут. МПК не экспрессируют маннозные рецепторы. Однако маннаны и полимерные комплексы, содержащие маннозу, также хорошо усиливают секрецию ИЛ-8 моноцитами [Kosaka et al., 2002]. Таким образом, очевидно наличие неидентифицированных рецепторов, играющих ключевую роль в продукции ИЛ-8 моноцитами, которые нами идентифицированы как TLR4.

Таким образом, нами существенно расширены представления о механизме действия ХГ на уровне моноцитов. Вероятно, возможность подобного взаимодействия могла сложиться в процессе эволюции, так как ХГ и Toll-подобные белки являются филогенетически древними молекулами [Acevedo, 2002]. Можно предположить, что связывание ХГ с TLR4 является одним из фетопротективных механизмов в период беременности, поскольку теоретически способно ограничивать ЛПС-индуциро-ванные патологические реакции, приводящие к самопроизвольным абортам. В пользу этого предположения служит тот факт, что введение Р-субъединицы ХГ (или родственных синтетических олигопептидов) в критических состояниях, индуцированных присутствием большого количества ЛПС, способно останавливать воспалительные реакции [van den Berg et al., 2011]. Показано, что ХГ-зави-симые олигопептиды имеют терапевтический потенциал для ослабления угрожающего жизни воспаления и повреждения органов, ассоциированного с травмой и геморрагическим шоком и in vivo на мышиной модели супрессирует ТЕК4-опосредо-ванное воспаление [van den Berg et al., 2011]. Блокада глюкокортикостероидных рецепторов приводит к отмене этих эффектов. Помимо этого, олигопептид работает и через АКТГ-рецептор, в то время как роль ЛГ-рецептора в этих процессах пока не изучена [van der Zee et al., 2010]. Эти результаты раскрывают новую стратегию поиска потенциальных терапевтических средств. Вероятнее всего, продукты деградации ХГ, а также ХГ-подобные олигопептиды оказывают выраженные противовоспалительные эффекты в силу своей способности выступать как конформационные антагонисты ЛПС. В отношении взаимодействия цельной молекулы ХГ с TLR4 хотелось бы добавить, что активация этих рецепторов также ведет к повышению уровня цАМФ внутри клетки, что снимает существующие противоречия [Song et al., 2007]. Данные, полученные в 2012 г. С. Feng с коллегами, показывают, что сиаловые остатки (а молекула ХГ является высокосиализированной) модулируют

ЛПС-сигналинг через TLR4. Таким образом, предложенная нами концепция «альтернативной» рецепции ХГ находит все больше экспериментальных подтверждений. Существование множественной рецепции для ключевого гормона беременности существенно расширяет существующие представления о фундаментальных основах взаимодействия гормон-рецептор.