Влияние хронического радиационного воздействия в разные периоды онтогенеза на частоту встречаемости микроядер в клетках щитовидной железы

СВА, микроядерный тест, тироциты, хрониче- интерфазных клеток с добавочными ядерными тельцами-микроядрами [3-5]. Наиболее часто для этих целей используются непрерывно размножающиеся популяции клеток, например, эритроидные клетки костного мозга [6, 7]. В последнее время показано, что микроядерный тест на фолликулярных тироцитах по чувствительности сопоставим с таковым на эритроидных клетках костного мозга, однако по сравнению с последним позволяет регистрировать действие вещества в более широком диапазоне доз [8]. В серии экспериментов на модели предварительно стимулированных к размножению фолликулярных тироцитов (гемитироидэктомия) в опытах in vivo на крысах линии Вистар было показано, что микроядерный тест является чувствительным методом оценки интенсивности влияния генотоксичных агентов (метилнитрозомочевины) на тиреоидную паренхиму щитовидной железы [9]. На крысах линии Вистар были получены результаты, свидетельствующие о высокой информативности микроядерного теста при исследовании воздействия низкоинтенсивного γ-излучения на процессы формирования фолликулярных тиро-цитов с микроядрами в ЩЖ [10].

Цель работы: с помощью микроядерного теста проанализировать состояние клеток ЩЖ животных из природных популяций и лабораторных мышей, подвергнутых воздействию хронического низкоинтенсивного ионизирующего излучения в разные периоды онтогенеза.

Материал и методы исследования. Исследование проводили на половозрелых полевках-экономках, привезенных с участков с нормальным и повышенным содержанием естественных радионуклидов (зона средней тайги, Ухтинский район Республики Коми). Радиевый участок образовался в результате интенсивного освоения в 1940-е годы подземных вод, богатых по содержанию ²²⁶Ra. В условиях загрязнения данной территории популяция полевок-экономок обитает уже более 60-ти лет. Средняя мощность дозы внешнего γ-излучения на радиевом участке составляла 50-2000 мкР/ч, на контрольном – 10-15 мкР/ч. Суммарная поглощенная доза облучения для группы животных изменялась от 1,2 до 24,0 сЗв/год [11]. После отлова полевки с обоих участков были доставлены в виварий Института биологии, где их содержали в идентичных условиях в течение трех месяцев до момента декапитации.

Экспериментальные исследования были проведены на половозрелых мышах линии СВА, которые были разделены на две группы. В целях изучения цитогенетического состояния клеток ЩЖ после радиационного воздействия в ранние периоды онтогенеза из животных I экспериментальной группы были сформированы семьи (самец + 1-2 самки), которых содержали в условиях повышенного радиационного фона (мощность дозы – 4000 мкР/ч). Полученное от этих животных потомство (первое поколение) находилось под воздействием γ-излучения с момента зачатия и до достижения ими двух месячного возраста после рождения (общая продолжительность облучения, включая пренатальный период, составила 79 сут), поглощенная доза – 8±2 сГр. Животных II группы подвергали хроническому внешнему облучению в течение 10 сут. (мощность дозы – 40000 мкР/ч), суммарная поглощенная доза, также как и в предыдущем варианте эксперимента составила 8±2 сГр. Всех мышей декапитировали сразу после прекращения облучения. В эксперименте источником γ-излучения были две ампулы со стальной оболочкой, содержащие 0,474×106 и 0,451×106 кБк 226Ra, разнесенные друг от друга на расстояние 2,5 м (Лицензия СЕ-03-205-2005). Мощность дозы измеряли радиометром ДРГЗ (Свидетельство о поверке № 099325). Суммарную поглощенную дозу определяли при помощи индивидуальных дозиметров типа DTU-1 с детекторами ДТГ-4 при помощи дозиметрической термолюминесцентной установки ДВГ-02ТМ. Каждой экспериментальной группе соответствовал свой контроль. Контрольные особи были одного возраста с экспериментальными, их содержали в виварии в условиях нормального радиационного фона и подвергали декапитации одновременно с облученными животными.

Для проведения микроядерного теста ЩЖ подвергали ферментативной обработке с помощью коллагеназы (Collagenase type IA, 2,5 мг/мл, t=370С) в течение 30 мин. Для отмывания тиро-цитов от коллагеназы добавляли 500 мкл холодного фосфатно-солевого буфера [12]. Отмытую суспензию клеток обрабатывали в течение 20 минут 0,56% гипотоническим раствором хлорида калия (t=370С, 20 мин), фиксировали метанолуксусной кислотой и раскапывали на обезжиренные предметные стекла, которые сушили на воздухе. Готовые препараты изолированных ти-роцитов окрашивали акрединовым оранжевым и анализировали под люминесцентным микроскопом «Infinity» с системой захвата и обработки изображений при ув. ок.10 х об.100. От каждого животного подсчитывали по 1000 тироцитов, в которых оценивали частоту встречаемости клеток с микроядрами. Всего было приготовлено препаратов от 69 животных.

Результаты и обсуждение. Полученные результаты показали, что у полевок-экономок, привезенных с радиевого участка происходит повышение (р≤0,05) количества микроядер в ЩЖ в 2,7 раза по сравнению с контролем (рис. 1). Высокая индукция абберантных клеток спустя длительное время после облучения, вероятно, связана с тем, что животные из природных популяций получали кроме внешнего облучения инкорпорированные радионуклиды с пищей, водой и при дыхании, а также находились под воздействием облучения в течение всего пренатального и раннего постнатального онтогенеза.

В проведенном нами эксперименте на линейных мышах, развивающихся в период пренатального и раннего постнатального онтогенеза в условиях хронического низкоинтенсивного γ-излучения, также зарегистрировано достоверное повышение количества микроядер в тироцитах по сравнению с контрольными особями (у самцов в 1,4 раза, у самок в 1,5 раза). У некоторых животных были отмечены клетки с двумя микроядрами (рис. 2). Повышенная индукция цитогенетических повреждений в ЩЖ животных этой экспериментальной группы, очевидно, связана с тем, что особи подвергались воздействию радиации с самых ранних стадий онтогенеза, когда происходит закладка и формирование тканей, органов и систем, в период, когда организм особенно чувствителен к влиянию неблагоприятных факторов среды. Из литературы известно, что воздействие низкоинтенсивного γ-излучения в раннем онтогенезе (в течение 39 сут.) на мышей линии СВА в дозе 4 сГр вызывало долговременные изменения некоторых морфометрических показателей коры надпочечников [2]. Отсроченные эффекты, в числе которых увеличение количества повреждений ДНК лейкоцитов крови самцов, повышение смертности и снижение массы тела были выявлены при хроническом воздействии γ-излучения в дозе 8 сГр на ранних этапах онтогенеза мышей [13].

□ Облучение □ Контроль

Рис. 1. Частота образования тироцитов с микроядрами (‰) у животных после хронического низкоинтенсивного γ–излучения в разные периоды онтогенеза.

По оси ординат : 1 – полевки-экономки; 2, 2а и 3 – мыши линии СВА; 2 – облучение животных в ранние периоды онтогенеза (I эксперимент); 3 – облучение взрослых животных (II эксперимент). 1, 2, 3 – самцы, 2а – самки. * -различия достоверны по отношению к контролю при р≤0,05.

Анализ количества микроядер у половозрелых мышей, которых также, как и животных первой экспериментальной группы, облучали в дозе 8 сГр, не показал достоверных различий в числе микронуклеированных тироцитов по сравнению с контрольными значениями. Вероятно это связано с тем, что развитие органов и тканей у этой группы животных осуществлялось в условиях нормального радиационного фона и облучению подвергались уже половозрелые особи.

а)

б)

Рис. 2. Тироциты с одним (а) и двумя (б) микроядрами у мышей линии СВА после радиационного воздействия в ранние периоды онтогенеза (8 сГр)

Выводы:

• 1.    Эффективность хронического воздействия низкоинтенсивного γ-излучения на фолликулярный эпителий ЩЖ полевок-экономок, обитающих на участке с повышенным уровнем радиоактивного загрязнения, проявлялась в усилении формирования клеток с микроядрами по сравнению с животными с контрольного участка.

• 2.    У мышей линии СВА, развивающихся в период раннего онтогенеза в условиях воздействия хронического низкоинтенсивного γ-излучения (8 сГр), происходит усиление формирования клеток с микроядрами.

• 3.    У половозрелых мышей после хронического облучении в такой же суммарной поглощенной дозе, как и в предыдущем варианте эксперимента, каких-либо изменений в частоте образования микроядер в клетках ЩЖ не обнаружено.

Работа поддержана грантом РФФИ в рамках научного проекта № 13-04-01750а и проекта Президиума РАН «Молекулярно-клеточная биология» № П12-П-4-1021.