Влияние хронического стресса на нефротоксическое действие парацетамола: гистоморфологический и биохимический анализ

Введение. Хронический стресс представляет собой состояние длительного нарушения гомеостатического равновесия организма, что значительно повышает риск возникновения различных патологий [1–4]. Ключевая роль в развитии стресс-индуцированных повреждений принадлежит гипоталамо-гипофизарно-надпо-чечниковой оси и симпатоадреналовой системе, активация которых приводит к каскаду физиологических и биохимических изменений [5-8]. Одним из центральных звеньев патогенеза является окислительный стресс, который, вступая во взаимодействие с психоэмоциональным стрессом, формирует порочный круг, усугубляющий повреждение клеток и тканей [9-12].

Особый интерес представляет изучение комбинированного воздействия хронического стресса и ксенобиотиков, в частности, лекарственных средств. Парацетамол, будучи широко применяемым анальгетиком-антипиретиком, при определенных условиях обладает гепатотоксическим действием, во многом обусловленным индукцией окислительного стресса [13-16]. В условиях хронического стресса, когда адаптационные резервы организма и антиоксидантная защита могут быть истощены, токсическое действие парацетамола может потенцироваться.

В настоящее время гистоморфологиче-ские и биохимические изменения, возникающие при сочетанном воздействии парацетамола и хронического стресса недостаточно изучены, что определяет актуальность настоящего исследования.

Цель исследования. Оценить гистомор-фологические и биохимические показатели у крыс при внутрижелудочном введении парацетамола на фоне хронического стресса.

Материалы и методы. В качестве объектов исследования выступили 48 аутбредных крыс обоего пола, вес которых находился в диапазоне от 190 до 210 г. Возраст подопытных особей на момент начала эксперимента составлял 10–12 нед. Содержание животных осуществлялось в специально приспособленном виварии, где им был обеспечен свободный доступ к пище и воде, за исключением ситуаций, обусловленных требованиями протокола. Все манипуляции, включая уход, кормление и процедуру эвтаназии, выполнялись в строгом соответствии с нормами российского законодательства, регламентирующего работу с лабораторными животными, включая ГОСТ 33215-2014 «Руководство по содержа- нию и уходу за лабораторными животными. Правила оборудования помещений и организации процедур». Дополнительно были учтены положения Европейской конвенции о защите позвоночных животных, используемых для экспериментальных и иных научных целей (ETS № 123), а также Директивы Европейского парламента и Совета 2010/63/EC по защите животных, применяемых в научных целях. Разрешение на проведение исследования было получено от локального этического комитета ФБУН «Уфимский НИИ медицины труда и экологии человека» (протокол № 01-1 от 22 января 2025 г.). До начала исследования крыс методом рандомизации разделили на 4 равные группы по 12 особей: по 6 самок и 6 самцов. Продолжительность экспериментального периода составила 28 дней.

Животным, отнесенным к группам «Парацетамол» и «Парацетамол + стресс», в рабочие дни 1 раз в сутки внутрижелудочно (при помощи зонда) вводили водный раствор парацетамола в дозировке 1000 мг на килограмм массы тела (концентрация 100 мг/см3). Указанная доза была определена на основе анализа литературных источников, согласно которым гепато-токсический эффект у крыс развивается при введении до 1500 мг/кг массы тела, в то время как для человека опасная интоксикация возможна уже при приеме 150–200 мг/кг. Особям из групп «Контроль» и «Стресс» аналогичным способом и с той же периодичностью вводили эквивалентный объем чистой дистиллированной воды.

Животные, включенные в группы «Парацетамол + стресс» и «Стресс», на протяжении всего исследования подвергались воздействию хронического стресса, моделирование которого осуществляли по методике непредсказуемого умеренного стресса [17], предусматривающей ежедневное применение 2–3 случайно выбранных стресс-факторов: социальная изоляция, иммобилизация, шумовое воздействие, непрерывное освещение в ночное время, а также временное ограничение доступа к пище и воде. Комбинации воздействий варьировали каждый день, причем один и тот же фактор не использовался дважды в течение суток.

На 29-е сут эксперимента крыс подвергли эвтаназии методом декапитации в соответствии с руководством AVMA 2020 г. Извлечение почек проводили в течение 2 мин после гибели животного. Фрагмент органа фиксировали в 10 % нейтральном забуференном формалине (ООО «Биовитрум», Россия) в течение 24 ч при температуре 4 °C.

После дегидратации в серии растворов с возрастающей концентрацией изопропанола материал заливали в парафин с использованием гистопроцессора Excelsior ES (Thermo Scientific, США). Срезы толщиной 5–7 мкм готовили на микротоме HM 340E (Thermo Scientific) и окрашивали гематоксилином и эозином (BioVitrum, Россия). Полученные цифровые изображения (увеличение ×200) регистрировали посредством камеры Celena X (Logos Biosystems, Республика Корея). Анализ изображений выполняли в программе QuPath v. 0.5.1 (Queen’s University Belfast, Великобритания).

Оценка функционального состояния почек включала определение в сыворотке крови ак- тивности ферментов: аспартатаминотрансферазы (АСТ), аланинаминотрансферазы (АЛТ), щелочной фосфатазы (ЩФ) и лактатдегидрогеназы (ЛДГ). Также анализировали концентрацию мочевой кислоты, общего белка, альбумина, мочевины, креатинина, триглицеридов и холестерина. Измерение биохимических показателей осуществляли с применением наборов реагентов «Вектор-Бест» (г. Новосибирск, Россия) на анализаторе Stat Fax 3300 (Awareness Technology, США) в полном соответствии с руководством производителя.

Обработка данных проводилась с использованием пакета SciPy в среде Python 3.10. Для статистической оценки применяли бутстрап-тест (10 000 ресэмплов) с поправкой Холма -Бонферрони для множественных сравнений. Статистически значимыми считали различия при p<0,05.

Результаты и обсуждение. Анализ биохимических параметров выявил выраженное полоспецифичное влияние парацетамола и хронического стресса на ферментативную активность (табл. 1).

Таблица 1

Table 1

Сравнительная характеристика биохимических показателей у крыс в контрольной и экспериментальных группах

Comparative characteristics of biochemical parameters in rats in the control and experimental groups

Показатель Parameter	Пол Gender	Контроль Control group	Стресс Stress group	Парацетамол Paracetamol group	Парацетамол + стресс Paracetamol + stress group
АСТ, Ед/л AST, U/L	М M	215,32±10,27	189,56±6,30	148,47±15,87 * , **	180,92±23,45
	Ж F	240,82±15,54	198,48±5,29 *	169,93±4,27 * , **	214,80±10,62 ***
АЛТ, Ед/л ALT, U/L	М M	92,42±4,63	75,60±2,87 *	95,26±4,95 **	98,83±14,18
	Ж F	83,51±3,59	75,64±2,05	65,87±1,59 * , **	92,37±7,20 ***
ЛДГ, Ед/л LDH, U/L	М M	1777,02±93,94	2265,69±86,57 *	1585,21±61,49 **	1827,51±104,12 **
	Ж F	2009,55±170,66	2058,23±79,94	1673,17±73,19 **	2060,66±111,18 ***
ЩФ, Ед/л ALP, U/L	М M	477,35±22,31	240,08±29,77 *	402,87±21,70 * , **	245,00±14,58 * , ***
	Ж F	246,66±19,03	319,16±16,72 *	243,49±27,50	291,51±46,98

Белок, г/л Protein, g/L	М M	65,61±2,98	63,38±1,58	63,06±1,52	60,06±0,97
	Ж F	73,56±1,44	68,64±1,46	71,69±1,05	70,53±3,44
Альбумин, г/л Albumin, g/L	М M	31,75±1,21	33,33±0,76	30,62±0,97 **	31,22±0,53 **
	Ж F	39,55±0,54	36,90±0,92	36,71±0,44 *	36,12±1,92
Мочевая кислота, мкмоль/л Uric acid, μmol/L	М M	55,50±2,28	69,79±3,68 *	70,71±6,01	86,86±4,37 *, **
	Ж F	115,82±11,81	105,50±4,45	97,43±2,91	133,27±7,45 **, ***
Мочевина, ммоль/л Urea, mmol/L	М M	9,81±0,22	6,60±1,05 *	8,29±0,73	11,47±0,36 *, **, ***
	Ж F	12,47±0,43	6,92±0,48 *	10,62±0,52 *, **	8,60±0,46 *, **, ***
Креатинин, мкмоль/л Creatinine, μmol/L	М M	55,16±3,12	64,78±7,79	43,39±2,86 *	53,29±8,20
	Ж F	56,16±2,96	52,67±7,42	31,03±1,31 *,**	35,44±2,92 *
Триглицериды, ммоль/л Triglycerides, mmol/L	М M	1,19±0,08	0,56±0,04 *	0,98±0,06 *, **	0,43±0,02 *, **, ***
	Ж F	0,97±0,06	0,71±0,14	2,28±0,41 *, **	0,76±0,07 ***
Холестерин, ммоль/л Cholesterol, mmol/L	М M	0,56±0,14	1,73±0,34 *	0,49±0,16 **	0,83±0,26
	Ж F	1,74±0,17	1,19±0,26	0,85±0,12 *	0,48±0,10 *, **

Примечание. Различия достоверны (р≤0,05) по сравнению с: * – группой «Контроль», ** – группой «Стресс», *** – группой «Парацетамол»; АСТ – аспартатаминотрансфераза, АЛТ – аланинаминотрансфераза, ЛДГ – лактатдегидрогеназа, ЩФ – щелочная фосфатаза.

Note. Differences are significant compared with: * – Control group, ** – Stress group, *** – Paracetamol group (p≤0.05); AST – aspartate aminotransferase, ALT – alanine aminotransferase, LDH – lactate dehydrogenase, ALP – alkaline phosphatase.

Изолированное введение парацетамола привело к статистически значимому снижению уровня АСТ как у самцов (148,47±15,87 Ед/л против 215,32±10,27 Ед/л в контроле, p=0,002), так и у самок (169,93±4,27 Ед/л против 240,82±15,54 Ед/л в контроле, p=0,001). У самок активность АСТ в группе «Парацетамол» также была существенно ниже, чем в группах «Стресс» (p=0,001) и «Парацетамол + стресс» (p=0,001). В противоположность этому хронический стресс вызывал значительное повышение уровня ЛДГ у самцов (2265,69±86,57 Ед/л против 1777,02±93,94 Ед/л в контроле, p=0,001). Парацетамол в этой модели проявлял протективное действие, снижая активность ЛДГ как при изолированном введении (1585,21±61,49 Ед/л), так и в комбинации со стрессом (1827,51±104,12 Ед/л) по сравнению с группой, подвергавшейся только стрессу (p=0,001 и p=0,005 соответственно). У самок наименьший показатель ЛДГ регистрировался в группе «Парацетамол»: его значения достигали 1673,17±73,19 Ед/л, что было значимо ниже, чем в группах «Стресс» и «Парацетамол + стресс» (p<0,05). Активность АЛТ оказалась минимальной в группе «Стресс» у сам- цов (75,60±2,87 Ед/л против 92,42±4,63 Ед/л в контроле, p=0,011) и в группе «Парацетамол» у самок (65,87±1,59 Ед/л). Комбинированное воздействие у самок, напротив, вызывало рост данного показателя (92,37±7,20 Ед/л), значения которого значимо превышали таковые в группе «Парацетамол» (p=0,001).

При изучении показателей азотистого обмена и почечной функции наиболее выраженные сдвиги были обнаружены при комбинированном воздействии факторов.

У самцов крыс группы «Парацетамол + стресс» зафиксированы максимальные уровни мочевины (11,47±0,36 ммоль/л против 9,81±0,22 ммоль/л в контроле, p=0,001) и мочевой кислоты (86,86±4,37 мкмоль/л против 55,50±2,28 мкмоль/л в контроле, p=0,001). У самок наибольшая концентрация мочевой кислоты также наблюдалась при комбинированном воздействии, когда она достигала 133,27±7,45 мкмоль/л, что было достоверно выше, чем в группах «Стресс» и «Парацетамол» (p<0,01).

Изолированный стресс, в свою очередь, приводил к снижению уровня мочевины у животных обоих полов. Содержание креатинина было значимо снижено на фоне приема парацетамола как у самок (31,03±1,31 мкмоль/л против 56,16±2,96 мкмоль/л в контроле, p=0,001), так и у самцов (43,39±2,86 мкмоль/л против 55,16±3,12 мкмоль/л в контроле, p<0,05).

Исследование липидного обмена выявило противоположные эффекты у разных полов.

У самцов все экспериментальные воздействия приводили к снижению уровня триглицеридов относительно контрольных значений (1,19±0,08 ммоль/л), причем наиболее заметным эффект был в группе «Парацетамол + стресс» (0,43±0,02 ммоль/л, p=0,001). У самок, напротив, парацетамол вызывал значительное повышение концентрации триглицеридов (2,28±0,41 ммоль/л против 0,97±0,06 ммоль/л в контроле, p=0,007). Уровень холестерина был статистически значимо повышен у самцов при стрессе (1,73±0,34 ммоль/л против 0,56±0,14 ммоль/л в контроле, p=0,006). У самок же парацетамол как в чистом виде, так и в комбинации со стрессом, обусловливал достоверное снижение холестерина (p<0,001). Что касается белкового обмена, то статистически значимых межгрупповых различий в уровне общего белка выявлено не было. При этом у самок зафиксировано значимое снижение концентрации альбумина под действием парацетамола (36,71±0,44 г/л против 39,55±0,54 г/л в контроле, p=0,001).

Результаты гистоморфологического исследования показали прогрессию структурных изменений в почечной ткани в зависимости от характера экспериментального воздействия. В контрольной группе наблюдалась нормальная гистоархитектоника с четкой дифференциацией коркового и мозгового вещества (рис. 1).

Рис. 1. Микрофотография препарата почки животного контрольной группы. Часть коркового (1) и мозгового (2) вещества почек крыс контрольной группы. Окраска гематоксилином и эозином; исходное увеличение ×200

Fig. 1. Micrograph of a kidney section from a control group animal. Part of the renal cortex (1) and medulla (2). H&E staining; original magnification ×200

Почечные тельца и капиллярные клубочки были сохранны, просветы проксимальных и дистальных канальцев четко определялись, патологические изменения отсутствовали.

В группе «Стресс» регистрировались умеренные изменения при сохранении общей структуры органа (рис. 2). Строение клубочков не было нарушено, отмечалось умеренное полнокровие сосудов без признаков нарушения реологии крови. Патологических изменений ядер и вакуолярной дегенерации не обнаружено.

Рис. 2. Микрофотография препарата почки животного, подвергнутого воздействию стрессовых факторов.

Часть коркового (1) и мозгового (2) вещества почек крыс, подвергшихся влиянию стресса.

Окраска гематоксилином и эозином; исходное увеличение ×200

Fig. 2. Micrograph of a kidney section from an animal exposed to stress. Part of the renal cortex (1) and medulla (2). H&E staining; original magnification ×200

Группа «Парацетамол» демонстрировала признаки токсического поражения (рис. 3). Выявлялось нарушение проходимости канальцев с участками исчезновения просветов, набухание цитоплазмы клеток. Обнаружены скопления эритроцитов в просветах канальцев, полнокровие сосудистых клубочков с повышенной клеточностью и «лапчатостью». Отмечалась вакуолизация эпителия в проксимальных отделах.

Рис. 3. Микрофотография препарата почки животного, подвергнутого воздействию парацетамола. Измененные сосудистые клубочки (1) с дистальными (2) и проксимальными (3) канальцами, в просветах которых обнаруживались скопления эритроцитов (4). Окраска гематоксилином и эозином;

исходное увеличение ×200

Fig. 3. Micrograph of a kidney section from an animal exposed to paracetamol. Altered vascular glomeruli (1) with distal (2) and proximal (3) tubules, containing accumulations of erythrocytes (4) in the lumens.

H&E staining; original magnification ×200

Наиболее выраженные патологические изменения наблюдались в группе «Парацетамол + стресс» (рис. 4). Картина включала деформацию почечных телец с отсутствием просвета капсул, уменьшение размеров сосуди- стых клубочков, очаги разрастания соединительной ткани, массивные скопления эритроцитов в интерстиции и просветах канальцев. Эпителий проксимальных канальцев имел признаки набухания и вакуолизации.

Рис. 4. Микрофотография препарата почки животного, подвергнутого воздействию парацетамола на фоне стресса. Очаг разрастания соединительной ткани (1) с участками скопления эритроцитов (2) и деформированными почечными тельцами (3). Окраска гематоксилином и эозином;

исходное увеличение ×200

Fig. 4. Micrograph of a kidney section from an animal exposed to paracetamol combined with stress. A focus of connective tissue proliferation (1) with areas of erythrocyte accumulation (2) and deformed renal corpuscles (3). H&E staining; original magnification ×200

Результаты исследования демонстрируют, что как парацетамол, так и хронический стресс оказывают существенное и полоспецифичное влияние на биохимический статус и морфологию органов экспериментальных животных, причем их сочетанное воздействие носит синергетический характер.

Наблюдаемое снижение активности АСТ и АЛТ на фоне приема парацетамола может указывать на супрессию синтеза этих ферментов или на модуляцию препаратом метаболических процессов в гепатоцитах. В то же время значительное повышение ЛДГ в группе «Стресс» у самцов является классическим маркером клеточного повреждения и может быть следствием активации гипоталамо-гипофизарно-надпочеч-никовой оси и цитолитического действия высоких концентраций кортикостероидов [18].

Ключевым результатом исследования является подтверждение потенцирующего влияния хронического стресса на нефротоксические эффекты парацетамола. Резкий подъем уровня мочевины и мочевой кислоты в группе «Парацетамол + стресс» свидетельствует о зна- чительном нарушении азотистого обмена и функции почек. Этот эффект, по-видимому, реализуется через несколько механизмов: стресс-индуцированное снижение почечного кровотока, усиление перекисного окисления липидов и синергичное повреждение канальцевого аппарата [19, 20]. Данные гистологического исследования полностью подтверждают эту гипотезу, демонстрируя переход от начальных признаков гломерулонефрита при изолированном введении парацетамола к формированию очагов склероза при комбинированном воздействии.

Выявленные половые различия в реакции липидного обмена (противоположная динамика уровня триглицеридов) подчеркивают роль половых гормонов в модуляции метаболических путей. Антилипидемический эффект парацетамола у самцов и его противоположное действие у самок требуют дальнейшего изучения для понимания молекулярных механизмов, стоящих за этой дифференциацией. Значимое снижение холестерина у самок на фоне приема парацетамола может быть связано с модуляцией активности ключевых ферментов его синтеза.

Заключение. Парацетамол и хронический непредсказуемый стресс оказывают значимое и полоспецифичное влияние на широкий спектр биохимических показателей и морфологию почек у крыс. Установлен синергетический эффект комбинированного воздействия, проявляющийся в выраженном нарушении азотистого обмена и прогрессировании структурного повреждения почечной ткани вплоть до развития очагов склероза. Выявленные половые различия подчеркивают необходимость учета гендерного фактора при оценке безопасности фармакологических препаратов. Полученные данные указывают на потенциальный риск усиления нефротоксичности парацетамола в условиях хронического стресса и подчеркивают необходимость дальнейших исследований в этой области.

Исследование было выполнено в рамках отраслевой научно-исследовательской программы Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека на 2021–2025 гг.