Влияние хронической нейрогенной боли на динамику функционирования no-системы в процессе роста меланомы B16/F10 у самцов мышей

Результаты эпидемиологических исследований показывают, что частота нейрогенной боли в популяциях разных стран мира составляет 6–7 % [1]. У онкологических пациентов боль, имеющая свою специфику, содержит и нейрогенный компонент, ее встречаемость достигает 33–40 %, увеличиваясь в терминальной стадии заболевания до 90 % [2, 3]. Исследования, проводимые в этой области, свидетельствуют о существовании половых различий в болевой чувствительности, тяжести боли, ответах на боль, в механизмах формирования и развития боли [1, 4–7]. С другой стороны, анализ эпидемиологических данных по меланоме кожи показал наличие различий у мужчин и женщин в частоте заболеваемости, выживаемости, в характере течения меланомы не только у людей, но и в эксперименте [8–10].

В проведенных нами исследованиях на модели роста и развития перевивной меланомы B16/F10 на фоне экспериментальной хронической нейрогенной боли была обнаружена не только активация роста опухоли, но и установлены половые различия в течении злокачественного процесса [11, 12]. Возможным механизмом такой стимуляции роста опухоли может быть активация неоангиогенеза. Показана роль ангиогенеза при боли [13, 14]. Хроническую боль сопровождает хроническое воспаление, реализующееся через сложную сеть цитокинов, производимых глиальными и иммунными клетками [5, 15]. Воспаление и ангиогенез частично связаны через белки семейства VEGF [13], которые опосредуют ангио- и лимфангиогенез и в процессе роста опухоли. Данные литературы подтверждают и результаты наших исследований, показавшие изменение состояния системы проан-гиогенных факторов роста у мышей в состоянии хронической нейрогенной боли и при росте меланомы на фоне боли [16]. При этом были выявлены различия в динамике содержания компонентов вазоактивной NO-системы у самок мышей в состоянии хронической боли, при обычном росте меланомы и при росте опухоли на фоне хронической нейрогенной боли [17].

Функционирование системы оксида азота (NO-система) значительно изменяется как по мере развития боли, так и в процессе канцерогенеза [18–21], компоненты которой опосредуют не только действие проангиогенных факторов, но и выполняют важную роль в активации различных митогенных путей, а также в процессах метастазирования [22–24]. Дозозависимость проопухолевых эффектов NO обеспечивается через регуляцию экспрессии NO-синтаз и метаболическую регуляцию их активности. Центральным звеном регуляции активности ферментов является доступность субстрата – аргинина и уровень ингибитора – асимметричного диметиларгинина (АДМА) [23]. Кроме того, NO может быть получен из нитрата и нитрита, особенно в гипоксических условиях [25]. Также показана важная роль в канцерогенезе второго продукта реакции – цитруллина, участвующего в метаболической перестройке и в процессах цитруллинирования белков, сопровождающих опухолевую прогрессию [26–28].

Цель исследования состояла в изучении уровня компонентов NO-системы у самцов мышей в процессе роста перевивной меланомы B16/F10 на фоне ХрБ.

Материал и методы

Статистическую обработку результатов проводили с помощью программ Microsoft Excel 2010 и Statistica 10.0, в каждой группе определяли среднее значение ± стандартная ошибка. Значимость различий между группами оценивали с помощью критериев Стьюдента и Манна–Уитни. Статистически значимыми считали различия при p<0,05, при 0,05

Результаты

В коже самцов мышей с хронической болью по сравнению с группой интактных самцов (табл. 1) обнаружено очень значительное увеличение концентрации NOS-3 и NOS-2 – в 34,7 и в 10,2 раза соответственно (р<0,001), их ингибитора АДМА – в 1,96 раза (р<0,05). Концентрация общего нитрита была ниже в 2,4 раза (р<0,001).

У самцов мышей из группы сравнения в не пораженной опухолью коже на 1-й нед после перевивки опухоли статистически значимо была снижена концентрация NOS-3 – в 4,4 раза (p<0,01), цитруллина – на 46,8 % (p<0,01) и нитротирозина – на 31,6 % (p<0,05), при этом концентрация АДМА была увеличена на 61,5 % (p<0,05) по сравнению с уровнем у интактных животных. На 2-й нед, при появлении опухоли в коже самцов оставалась по-прежнему сниженной концентрация NOS-3 и цитруллина – в среднем в 2,55 раза (p<0,01), однако при этом наблюдалось повышение концентрации общего нитрита в 1,82 раза (p<0,05) по сравнению с уровнем у интактных животных. На 3-й нед экспе- римента значимо изменялись практически все исследованные показатели: снизились концентрации NOS-3 в 3,7 раза, NOS-2 на 34,9 %, цитруллина на 47,7 %, нитротирозина на 23,8 % (p<0,05– p<0,01), выросли концентрации АДМА в 3,0 раза и аргинина в 1,75 раза (p<0,05– p<0,01) по сравнению с уровнем у интактных животных.

В непораженной опухолью коже на протяжении 3 нед у самцов мышей основной группы концентрация NOS-3 оставалась значительно выше уровня в группе сравнения – в среднем в 83 раза (p<0,001), однако ниже по сравнению с уровнем в контрольной группе (хроническая боль) – в среднем на 39 % (p<0,05; p<0,001). Концентрация NOS-2 статистически значимо снизилась к 3-й нед, достигнув минимального уровня за весь период наблюдения – на 42 % ниже, чем на предыдущих сроках (p<0,001). При этом она оставалась в среднем в 4,7 раза (p<0,001) выше значений в группе сравнения, но ниже уровня в контрольной группе в 3,2 раза (p<0,001). Концентрация АДМА на протяжении 3 нед наблюдения не изменялась, оставаясь выше уровня как в контрольной группе – в среднем на 50 % (p<0,01–0,05

Концентрация аргинина на протяжении 3 нед после перевивки опухоли также статистически значимо не изменялась и не отличалась от уровня в контрольной группе, оставаясь выше уровня в группе сравнения в среднем на 74 % (p<0,001). Концентрация общего нитрита была статистически значимо повышена на 1-й нед – на 68,7 % (p<0,05) по сравнению с контролем, но к 3-й нед она снижалась, достигая значений в контрольной группе, при этом становясь статистически значимо ниже значений в группе сравнения в 2,3 раза (p<0,001). Концентрация цитруллина в процессе роста опухоли на фоне боли постепенно увеличивалась, достигая значимо более высоких значений, чем на соответствующем предыдущем сроке наблюдения, а также по сравнению с уровнем в контрольной группе и в группе сравнения: к 3-й нед – в 4,7 раза (p<0,001) и в 8,9 раза (p<0,001) соответственно (табл. 1).

У самцов мышей из группы сравнения в ткани опухоли (табл. 2) было обнаружено, что на 2-й нед (появление опухоли) концентрация NOS-3 была значимо снижена – в 3,2 раза (p<0,01), а концентрация АДМА увеличена в 6,6 раза (p<0,001) по сравнению с уровнем в здоровой коже интактных самцов. На 3-й нед эксперимента концентрация NOS-3 была значимо выше значения на 2-й нед в 2,4 раза (p<0,05) и не отличалась от уровня в здоровой коже интактных самцов. Концентрация NOS-2 была в среднем на 47,4 % ниже, чем на 2-й нед роста и чем в коже интактных самцов (p<0,05– p<0,01). Выявлено статистически значимое увеличение концентрации АДМА – в 6,3 раза (p<0,001) по сравнению с уровнем в коже интактных животных. Изменение концентраций аргинина,

Таблица 1/table 1 Динамика концентрации компонентов nO-системы в коже самцов мышей Changes in the concentration of nO-system components in the skin of male mice
Группы экспе-	NOS-3, нг/г	NOS-2, нг/г	АДМА,	Аргинин,	Общий ни-	L-цит-	Нитроти-
риментальных животных/ Groups of experimental animals	ткани/	ткани/	мкМ/г ткани/	мкМ/г ткани/	трит, мкМ/г ткани/ Total nitrite, μM / g tissue	руллин, мкМ/г ткани/ L-citrullin, μM / g tissue	розин, нМ/г ткани/ Nitrotirosin, nM / g tissue
	NOS-3, ng/g tissue	NOS-2, ng/g tissue	ADMA μM / g tissue	Arginine, μM / g tissue
Кожа интактная/
Intact skin	0,48 ± 0,03	0,96 ± 0,11	0,26 ± 0,02	72,5 ± 6,5	9,6 ± 0,7	21,8 ± 1,4	0,96 ± 0,07
Кожа на фоне ХрБ
(контроль)/	16,2 ± 1,6	9,8 ± 1,1	0,51 ± 0,08	102,5 ± 12,9	4,1 ± 0,6	21,8 ± 1,8	1,1 ± 0,01
Skin with presence of chronic pain (control)	р1<0,001	р1<0,001	р1<0,05	0,1>p1>0,05	р1<0,001
1-я нед роста В16/F10/Week 1 of В16/F10 growth
Группа сравнения/	0,11 ± 0,01	1,26 ± 0,17	0,42 ± 0,03	62,9 ± 5,8	10,3 ± 1,8	11,6 ± 0,9	0,66 ± 0,02
Comparison group	р1<0,01		р1<0,05			р1<0,01	р1<0,05
	10,1 ± 0,4	5,1 ± 0,2	0,86 ± 0,06	122,8 ± 3,8 р1<0,001 р4<0,001	6,85 ± 0,9 р1<0,05 рк<0,05	48,6 ± 4,1
Основная группа/	р1<0,001	р1<0,001	р1<0,001			р1<0,01	0,82 ± 0,09
Main group	рк<0,001	рк<0,001	pк<0,01			pк<0,01	pк<0,05
	р4<0,001	р4<0,001	р4<0,001			р4<0,001
2-я нед роста В16/F10/Week 2 of В16/F10 growth
					17,5 ± 1,6	8,5 ± 1,1
Группа сравнения/ Main group	0,19 ± 0,03 р1<0,01	1,1 ± 0,2	0,32 ± 0,04	73,3 ± 4,8	р1<0,05 p2<0,05	р1<0,001 0,1>p2>0,05	0,8 ± 0,08
	13,8 ± 1,0	5,57 ± 0,48	0,73 ± 0,06	112,1 ± 4,7 р1<0,001 р4<0,001	3,27 ± 0,28	81,6 ± 2,4 р1<0,001 рк<0,001 p2<0,001 р4<0,001
Основная группа/	р1<0,001	р1<0,001	р1<0,001		р1<0,001		0,94 ± 0,07
Main group	p2<0,01	рк<0,01	pк<0,05		p2<0,001
	р4<0,001	р4<0,001	р4<0,001		р4<0,001
3-я нед роста В16/F10/Week 3 of В16/F10 growth
Группа сравнения/ Comparison group	0,13 ± 0,01 р1<0,001	0,62 ± 0,06	0,79 ± 0,09	127,3 ± 9,2	8,08 ± 0,78 p3<0,001	11,4 ± 1,4 р1<0,05	0,73 ± 0,04 р1<0,05
		р1<0,05 p3<0,05	р1<0,01 p3<0,001	р1<0,05 p3<0,001
	10,9 ± 1,2	3,1 ± 0,2				102,0 ± 4,7
		р1<0,001	0,69 ± 0,05 р1<0,001 0,05 к<0,1		3,5 ± 0,2	р1<0,001
Основная группа/	р1<0,001 pк<0,05 0,05 3<0,1 р4<0,001	рк<0,001		128,8 ± 6,8	р1<0,001	рк<0,001	0,87 ± 0,06
Main group		p2<0,001 p3<0,001 р4<0,001		р1<0,001	p2<0,001 р4<0,001	p2<0,001 p3<0,001 р4<0,001

Примечание: статистически значимые различия: рк – относительно уровня в контроле – кожа животных с хронической болью; р1 – относительно уровня у интактных животных; р2 – относительно уровня на 1-й нед роста меланомы в соответствующей группе; р3 – относительно уровня на 2-й нед роста меланомы в соответствующей группе; р4 – относительно уровня в группе сравнения на соответствующем сроке наблюдения.

Notes: statistically significant differences: pk – relative to the level in the control – the skin of animals with chronic pain, p1 – relative to the level in intact animals, p2 – relative to the level at 1 week of melanoma growth in the corresponding group, p3 – relative to the level at 2 weeks of melanoma growth in the corresponding group, р4 – relative to the level in the comparison group at the appropriate follow-up period.

цитруллина и нитротирозина обнаружено только на уровне статистической тенденции в сравнении с показателями в коже интактных самцов.

У самцов мышей основной группы в ткани опухоли было выявлено, что концентрация NOS-3 в течение 3-х нед наблюдения значимо не изменялась и была многократно выше уровня значений в ткани опухоли самцов мышей группы сравнения, оставаясь стабильно ниже уровня в коже мышей контрольной группы (хроническая боль) – в среднем на 34 % (p<0,05– p<0,01). В отличие от этого концентрация NOS-2 с течением времени статистически значимо снижалась как по сравнению с уровнем на 1-й нед после перевивки – в среднем на 45 % (p<0,01–p<0,001), так и по сравнению с уровнем в коже мышей контрольной группы – до 4,3 раза на 3-й нед (p<0,001). При этом концентрация NOS-2 оставалась значительно выше уровня фермента в ткани опухоли в группе сравнения – в среднем в 3,3 раза (p<0,001). Концентрация АДМА в ткани опухоли на протяжении трех недель была ниже в среднем в 2 раза (p<0,05–p<0,001), чем в коже животных контрольной группы, и ниже уровня в опухоли самцов группы сравнения – в среднем в 4,8 раза (p<0,001).

Концентрация аргинина на 1-й нед была в 4,5 раза (p<0,001) ниже ее уровня в коже мышей

						Таблица 2/table 2
Динамика концентрации компонентов nO-системы в ткани опухоли у самцов мышей Changes in the concentration of nO-system components in the tumor tissue in male mice
Группы экспериментальных животных/ Groups of experimental animals	NOS-3, нг/г ткани/	NOS-2, нг/г ткани/	АДМА, мкМ/г ткани/	Аргинин, мкМ/г ткани/	Общий нитрит, мкМ/г ткани/ Total nitrite, μM / g tissue	L-цитруллин, мкМ/г ткани/ L-citrullin, μM / g tissue	Нитротирозин, нМ/г ткани/ Nitrotirosin, nM / g tissue
	NOS-3, ng/g tissue	NOS-2, ng/g tissue	ADMA μM / g tissue	Arginine, μM / g tissue
Кожа интактная/ Intact skin	0,48 ± 0,03	0,96 ± 0,11	0,26 ± 0,02	72,5 ± 6,5	9,6 ± 0,7	21,8 ± 1,4	0,96 ± 0,07
Кожа на фоне боли (контроль)/ Skin with presence of chronic pain	16,2 ± 1,6 р1<0,001	9,8 ± 1,1 р1<0,001	0,51 ± 0,08 р1<0,05	102,5 ± 12,9 0,1>p1>0,05	4,1 ± 0,6 р1<0,001	21,8 ± 1,8	1,1 ± 0,014
(control)
1-я нед роста В16/F10/Week 1 of В16/F10 growth
Группа сравнения/ Comparison group			Опухоль отсутствует/no tumor
Основная группа/	11,0 ± 0,7	4,82 ± 0,39	0,16 ± 0,02	22,9 ± 2,5	5,59 ± 0,7	80,4 ± 2,6	1,16 ± 0,1
Main group	рк<0,01	рк<0,001	рк<0,001	рк<0,001		рк<0,001
2-я нед роста В16/F10/Week 2 of В16/F10 growth
Группа сравнения/ Comparison group	0,15 ± 0,02 р1<0,01	1,2 ± 0,06	1,71 ± 0,22 р1<0,001	79,6 ± 6,1	11,8 ± 1,5	25,7 ± 1,9	1,04 ± 0,09
	11,1 ± 1,1 рк<0,05 р4<0,001	3,0 ± 0,4	0,44 ± 0,05 p2<0,001 р4<0,001	34,1 ± 2,6	5,80 ± 0,57 рк<0,05 р4<0,001	72,9 ± 8,4 рк<0,001 р4<0,001
Основная группа/ Main group		рк<0,001 p2<0,01 р4<0,001		рк<0,001 p2<0,01 р4<0,001			1,29 ± 0,11
3-я нед роста В16/F10/Week 3 of В16/F10 growth
Группа сравнения/ Comparison group	0,36 ± 0,037 p3<0,05	0,56 ± 0,028 р1<0,01 p3<0,05	1,64 ± 0,13 р1<0,001	51,3 ± 5,6 0,1>p1>0,05 p3<0,05	8,1 ± 0,8	15,0 ± 1,6 0,1>p1>0,05 p3<0,01	1,31 ± 0,18 0,1>p1>0,05
	10,6 ± 0,8 рк<0,01 р4<0,001	2,27 ± 0,2 рк<0,001 р4<0,001	0,29 ± 0,02	33,5 ± 2,6 рк<0,001 р4<0,01	5,69 ± 0,54 рк<0,05 р4<0,01	97,7 ± 4,7
Основная группа/ Main group			рк<0,05 p3<0,01 р4<0,001			рк<0,001 p3<0,05 р4<0,001	1,25 ± 0,09

Примечание: статистически значимые различия: рк – относительно уровня в контроле – кожа животных с хронической болью; р1 – относительно уровня у интактных животных; р2 – относительно уровня на 1-й нед роста меланомы в соответствующей группе; р3 – относительно уровня на 2 неделе роста меланомы в соответствующей группе; р4 – относительно уровня в группе сравнения на соответствующем сроке наблюдения.

Notes: statistically significant differences: pk – relative to the level in the control – the skin of animals with chronic pain, p1 – relative to the level in intact animals, p2 – relative to the level at 1 week of melanoma growth in the corresponding group, p3 – relative to the level at 2 weeks of melanoma growth in the corresponding group, р4 – relative to the level in the comparison group at the appropriate follow-up period.

контрольной группы. По мере роста опухоли она выросла в среднем на 47 % (p<0,01) на 2–3-й нед после перевивки (по сравнению со значениями в ткани опухоли на 1-й нед), оставаясь, однако, по-прежнему ниже уровня в контрольной группе – в 3 раза и в группе сравнения – в среднем на 46 % (p<0,01–p<0,001). Концентрация общего нитрита в течение всего срока наблюдения была стабильно ниже уровня в опухоли мышей группы сравнения – в среднем на 40 % (p<0,01–p<0,001). При этом концентрация цитруллина была значительно более высокой, чем в коже животных контрольной группы – в 3,7–4,5 раза (p<0,001) и в ткани опухоли группы сравнения – в 2,8–6,5 раза (p<0,001), достигая максимального увеличения на 3-й нед.

Обсуждение

Результаты исследования показали, что в состоянии хронической нейрогенной боли в коже самцов мышей наблюдаются неоднозначные изменения уровня компонентов NO-системы. С одной стороны, значительно выраженное увеличение концентрации обеих изоформ ферментов – эндотелиальной NOS-3 и индуцибельной NOS-2 – позволяет предположить активацию функционирования системы, при этом наблюдаемое снижение уровня общего нитрита может быть связано с активацией процесса нитрозилирования макромолекул. Важность данной модификации белков для ингибирования апоптоза и стимуляции пролиферации в клетках меланомы была показана ранее [29, 30]. Аналогичные, но менее выраженные изменения были обнаружены у самок мышей с хронической болью [17]. Возможно, такие изменения способствуют формированию состояния воспаления в коже и более раннему появлению подкожных опухолей у мышей (самок и самцов) с ростом меланомы на фоне хронической нейрогенной боли [11, 12]. С другой стороны, увеличение уровня ингибитора NO-синтаз асимметричного димети-ларгинина (АДМА), выявленное у самцов, может быть проявлением мобильной регуляции этих ферментов и метаболизма аргинина по другим путям, не связанным с работой NO-синтаз.

При росте опухоли после стандартной перевивки у самцов, в отличие от самок, изменения содержания компонентов NO-системы наблюдаются уже с 1-й нед роста опухоли [17]. В непораженной коже и в ткани опухоли наблюдаются снижение уровня ферментов и цитруллина, нарастание уровня аргинина и АДМА, что может свидетельствовать об ингибировании работы системы NO-синтаз в отличие от самок [17].

В динамике роста меланомы В16 на фоне хронической нейрогенной боли в коже и в опухоли у самцов мышей наблюдался значительно более высокий уровень изоформ NOS-3 и NOS-2, чем в группе со стандартной перевивкой опухоли и чем у самок мышей [17]. Это является признаком более активного функционирования системы NO-синтаз у самцов мышей, особенно на 1-й нед роста опухоли на фоне боли, когда был обнаружен максимальный уровень NOS-2 и общего нитрита в коже и максимальный уровень NOS-2 и минимальный уровень АДМА и аргинина в опухоли. Возможно, этим объясняется бóльшая скорость роста опухолей у самцов [12].

Экспрессия и активность NOS-3 увеличиваются при активации сигнального пути VEGFА [31, 32]. На модели меланомы, выросшей у мышей с дефицитом эндотелиальной NOS-3, было обнаружено, что опухоль имела меньшее количество сосудов по сравнению с меланомой, выросшей у животных дикого типа. При этом на этой же модели показано, что удаление индуцибельной NOS-2 в стромальных клетках не влияло на ангиогенез и морфологию сосудов [31]. Однако в исследовании H. Vahora et al. показано, что активация транскрипции NOS-2 опосредует участие других факторов в процессе ангиогенеза (EGF, COX-2, ANGPTL4) [22].

Отличительной особенностью являлось стабильное нарастание уровня цитруллина в коже в динамике роста опухоли на фоне боли, а также значительно